盧榮加 王建華 江常震

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍巖人民醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 龍巖 364100；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的原發(fā)性惡性腫瘤，當(dāng)前仍采用以手術(shù)為主的綜合治療手段〔1〕。但因為其浸潤性生長的特性，手術(shù)全切困難〔2〕；且腫瘤的異質(zhì)性較強，容易對放化療不敏感，致殘率及致死率高，探索其發(fā)生發(fā)展機制、尋找更為有效的治療策略對治療膠質(zhì)瘤具有重要意義〔3〕。分子靶向治療在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用逐漸引起關(guān)注〔4〕。miRNA與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為腦膠質(zhì)瘤臨床診斷、預(yù)后評估的新指標(biāo)及治療的新靶點〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-520a(3p)基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓相關(guān)聯(lián)〔6〕；miR-520a-3p與骨肉瘤〔7〕、結(jié)直腸癌〔8〕、非小細胞肺癌〔9〕的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但miR-520a-3p對膠質(zhì)瘤細胞的調(diào)控機制尚未清楚，本實驗探討miR-520a-3p如何影響膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲等行為。

1 材料與方法

1.1材料 膠質(zhì)瘤細胞U251、T98G和正常人星形膠質(zhì)細胞NHA(中國科學(xué)院上海細胞庫)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室、Matrigel(美國BD公司)；RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 膠質(zhì)瘤細胞U251、T98G和正常人星形膠質(zhì)細胞NHA使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；取處于對數(shù)生長期的細胞U251、T98G，將其分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-520a-3p組(轉(zhuǎn)染miR-520a-3p mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-NEK2組(轉(zhuǎn)染si-NEK2)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-520a-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-520a-3p)、pcDNA3.1-NEK2+ miR-520a-3p組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NEK2和miR-520a-3p)。

1.2.2MTT檢測細胞增殖 各組細胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.2.3Transwell檢測細胞遷移和侵襲 用無血清培養(yǎng)基重懸細胞；細胞遷移實驗：Transwell小室上室加200 μl 細胞懸液，培養(yǎng)24 h，擦去小室上層細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后用甲醛固定，再用結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照，計算遷移細胞數(shù)。細胞侵襲實驗：Matrigel鋪于Transwell小室上室，干燥后同細胞遷移實驗。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組細胞，依試劑盒說明書操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-520a-3p表達水平 提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明操作，然后進行qRT-PCR，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白后檢測蛋白濃度，而后進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至聚偏氟氯乙烯(PVDF)膜，封閉后加入一抗4℃孵育過夜，然后加入二抗室溫孵育2 h，顯影、定影，用Quantity One分析蛋白條帶吸光度，計算蛋白表達水平。

1.2.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-520a-3p對NEK2的靶向調(diào)控 構(gòu)建NEK2 3'UTR的野生型和突變型熒光素酶表達載體(WT-NEK2和MUT-NEK2)，將其與miR-520a-3p共轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細胞；依試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-520a-3p在膠質(zhì)瘤細胞U251、T98G和正常人星形膠質(zhì)細胞NHA中的表達 與NHA組細胞(1.18±0.06)相比，U251(0.63±0.04)、T98G(0.38±0.02)組細胞中miR-520a-3p的表達水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)?？梢?，miR-520a-3p在膠質(zhì)瘤細胞中下調(diào)表達。

2.2miR-520a-3p過表達對膠質(zhì)瘤細胞U251、T98G增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-520a-3p組膠質(zhì)瘤細胞U251、T98G中miR-520a-3p表達水平升高，Bcl-2蛋白的表達水平降低，Bax蛋白的表達水平升高，細胞活性降低，凋亡率升高(P<0.05，圖1，表1，表2)。

2.3miR-520a-3p過表達對T98G細胞遷移、侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-520a-3p組T98G細胞中MMP-2蛋白的表達水平降低，E-cadherin蛋白的表達水平升高，遷移和侵襲的T98G細胞數(shù)量降低(P<0.05)，圖2，見表3。

1，3：miR-NC組；2，4：miR-520a-3p組圖1 miR-520a-3p對膠質(zhì)瘤細胞U251、T98G凋亡及凋亡蛋白的影響

表1 過表達miR-520a-3p對U251細胞增殖、凋亡的影響

表2 過表達miR-520a-3p對T98G細胞增殖、凋亡的影響

圖2 miR-520a-3p過表達對T98G細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

表3 miR-520a-3p過表達對T98G細胞遷移、侵襲的影響

2.4miR-520a-3p靶向調(diào)控NEK2 TargetScan預(yù)測到NEK2與miR-520a-3p存在結(jié)合位點(圖3)。T-NEK2和miR-520a共轉(zhuǎn)染后細胞熒元素酶活性低于WT-NEK2和miR-NC共轉(zhuǎn)染后的細胞(0.35±0.01 vs 1.11±0.04，t=45.151,P<0.05)；MUF-NEK2和miR-520a-3p共轉(zhuǎn)染后細胞熒光素酶活性與MUT-NEK2和miR-NC共轉(zhuǎn)染后的細胞無顯著差異(1.14±0.05 vs 1.18±0.04，t=1.530,P>0.05)。過表達miR-520a-3p NEK2表達水平(0.15±0.01)較miR-NC組明顯降低(0.98±0.09，P<0.05)；抑制miR-520a-3p表達，NEK2表達水平(1.87±0.09)較anti-miR-NC組明顯升高(0.93±0.04，P<0.05)，見圖4。

圖3 miR-520a-3p靶向調(diào)控NEK2

1～4：miR-NC組,miR-520a-3p組,anti-miR-NC組,anti-miR-520a-3p組圖4 NEK2蛋白的表達

2.5抑制NEK2表達對T98G細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與 si-NC組相比，si-NEK2組T98G細胞中NEK2、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達水平均顯著降低(P<0.05)，Bax、E-cadherin蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)，T98G細胞活性顯著降低(P<0.05)，T98G細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)，T98G細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表4，表5，圖5。

表4 抑制NEK2表達對T98G細胞凋亡、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表5 抑制NEK2表達對T98G細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

圖5 NEK2、凋亡及侵襲蛋白的表達

2.6過表達NEK2能逆轉(zhuǎn)miR-520a-3p對T98G細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 與miR-520a-3p+pcDNA3.1組相比，miR-520a-3p+pcDNA3.1-NEK2組細胞中NEK2、Bcl-2、MMP-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Bax、E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞活性顯著升高(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6，表6，表7。

1～4：miR-NC組,miR-520a-3p組,miR-520a-3p+pcDNA3.1組,miR-520a-3p+pcDNA3.1-NEK2組圖6 NEK2、凋亡及侵襲蛋白的表達

表6 過表達NEK2對NEK2、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表7 過表達NEK2能逆轉(zhuǎn)miR-520a-3p對T98G細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

3 討 論

膠質(zhì)瘤發(fā)病率和死亡率較高，因其耐藥機制的限制，無法發(fā)揮放療及化療原有的治療效果〔9,10〕。miRNA參與了腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫應(yīng)答等過程〔11〕。miR-520a屬于人miR-520家族，該家族定位于人第19號染色體上〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-520a-3p可抑制骨肉瘤MG63細胞的增殖和遷移，促進細胞凋亡〔7〕。miR-520a-3p可以通過靶向表皮生長因子受體(EGFR)抑制細胞遷移，促進細胞凋亡，導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞周期停滯在G0/G1階段，減緩異種移植小鼠中腫瘤的生長〔8〕。miR-520a-3p通過靶向MAP3K2〔13〕、HOXD8〔14〕抑制非小細胞肺癌的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移；miR-520a-3p在肺癌干細胞中低表達，通過調(diào)控MAP3K2基因表達，誘導(dǎo)CD133+肺癌干細胞凋亡〔15〕。miR-520家族通過靶向核因子(NF)-κB和腫瘤生長因子(TGF)-β信號通路抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移侵襲〔16〕。miR-520a可調(diào)控ErbB4的表達并抑制食管鱗癌細胞的增殖與侵襲〔17〕。miR-520a-5p 靶向調(diào)控STAT3誘導(dǎo)細胞凋亡并抑制K562白血病細胞增殖〔18〕。miR-520a通過抑制AKT表達抑制HaCaT細胞的增殖和有絲分裂〔19〕。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p在膠質(zhì)瘤細胞中低表達，過表達miR-520a-3p可抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，還可靶向調(diào)控NEK2的表達。

NEK2是一種定位于中心體的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶〔20〕。NEK2在惡性膠質(zhì)瘤中顯著上調(diào)，對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其表達量與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)〔21〕。NEK2在肺癌中異常高表達，可作為肺癌早期檢測及患者預(yù)后的生物標(biāo)志物〔22〕。NEK2在乳腺癌中高表達，參與了乳腺癌的形成過程〔23〕；也是治療乳腺癌的分子靶標(biāo)〔24〕。沉默NEK2可抑制卵巢癌SKOV3細胞的侵襲〔25〕；NEK2的上調(diào)與卵巢癌中的耐藥性相關(guān)〔26〕。抑制NEK2表達可抑制膽管癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞死亡〔27〕。NEK2受miR-128的調(diào)節(jié)，其上調(diào)表達與結(jié)直腸癌的預(yù)后不良有關(guān)〔28〕。NEK2可通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)HepG2細胞的增殖，凋亡〔29〕。MBM-5可有效抑制NEK2的激酶活性，抑制胃癌腫瘤生長〔30〕。miR-195負調(diào)控NEK2的表達，抑制前列腺癌細胞的增殖〔31〕。miR-486-5p負調(diào)節(jié)NEK2，NEK2高表達促進肝癌細胞系的增殖，集落形成，遷移和侵襲〔32〕。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制NEK2表達可抑制膠質(zhì)瘤T98G細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。過表達NEK2能逆轉(zhuǎn)miR-520a-3p對膠質(zhì)瘤細胞T98G增殖、遷移侵襲的抑制和凋亡的促進作用。