帕力達(dá)·阿不力孜 張雷 卡比努爾·克依木 苗海軍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

心房顫動(dòng)(AF)是最常見(jiàn)的臨床心律失常形式，在65歲以上的老年人中發(fā)生率高于5%，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)〔1〕。AF除了其本身危害外，還能引起致命的并發(fā)癥，如腦血栓和腦卒中等〔2〕。AF的發(fā)病機(jī)制大致分為兩種：異位沖動(dòng)形成和心房折返學(xué)說(shuō)，但其確切機(jī)制尚未明確〔3〕。近年來(lái)，從基因、離子通道等方面對(duì)AF發(fā)病機(jī)制研究取得了重大進(jìn)展。研究表明，分布于心肌細(xì)胞上的通道基因與生命活動(dòng)密切相關(guān)，其單核苷酸多態(tài)性與離子通道的重構(gòu)、心房肌細(xì)胞的動(dòng)作電位有極大關(guān)聯(lián)性〔4,5〕。遺傳連鎖分析已經(jīng)鑒定了染色體10q22-24，6q14-16，5p13和11p15.5上的AF基因座〔6〕。其中在11p15.5中，鑒定了遺傳缺陷并發(fā)現(xiàn)其涉及鉀離子通道蛋白基因(KCNQ)1中的雜合錯(cuò)義突變，KCNQ1-鉀離子通道β亞基(KCNE)1和KCNQ1-KCNE2離子通道的功能增益導(dǎo)致緩慢性延遲整流鉀電流(Iks)〔7〕。利用候選基因方法，將KCNE2中的功能獲得性突變編碼導(dǎo)入內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)的離子通道，發(fā)現(xiàn)與兩家族的家族性AF相關(guān)〔8〕。由此可見(jiàn)，KCNE家族基因在AF的發(fā)生和進(jìn)展中有重要作用。關(guān)于AF的遺傳易感性知之甚少。通過(guò)遺傳學(xué)研究方法分析基因突變導(dǎo)致AF的機(jī)制研究有助于理解AF的分子機(jī)制和所導(dǎo)致的電生理改變。本研究擬探討KCNE2 和 KCNE3 基因單核苷酸多態(tài)性與AF的相關(guān)性，以期為新的診療手段和方法提供思路。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 納入本研究的AF患者(AF組)均為中國(guó)漢族人，樣本間無(wú)血緣關(guān)系，主要來(lái)自2013～2015年在新疆南疆和田地區(qū)墨玉縣、和田縣的5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，烏魯木齊市新農(nóng)大社區(qū)、和鋼社區(qū)，抽取有常住戶口者、年齡≥55歲者，共計(jì)251例，特發(fā)性AF 11例，器質(zhì)性AF 240例。從醫(yī)院體檢的體格檢查和心電圖檢查證實(shí)均無(wú)AF的個(gè)體中選取251例為對(duì)照組。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。AF的診斷標(biāo)準(zhǔn)：包括病史、體表和24 h動(dòng)態(tài)心電圖診斷。心電圖診斷標(biāo)準(zhǔn)為：P 波消失，代之以f波，特征為振幅、形態(tài)、節(jié)律不一，頻率為 350～600 次/min，心室節(jié)律(R-R間距)通常絕對(duì)不規(guī)則。 排除標(biāo)準(zhǔn)：排除家族性AF，排除合并瓣膜型心臟病、甲狀腺功能亢進(jìn)、心肌病、先天性心臟病、慢性肺源性心臟病、起搏器術(shù)后或心臟器質(zhì)性疾病手術(shù)后等樣本。研究過(guò)程中所涉及的資料收集及血樣采集均獲得研究對(duì)象和家人的同意，并簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組一般資料比較

1.2單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的選擇 采用標(biāo)簽SNP策略選擇KCNE2和KCNE3 基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行其與AF的相關(guān)性研究：首先在NCBI中SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http//：www.ncbi.nlm.nib.gov/SNP)中以KCNE2/KCNE3和homo為關(guān)鍵詞找到人類 KCNE2 基因SNP位點(diǎn)為2 375個(gè)，KCNE3基因SNP位點(diǎn)為3 361個(gè)。在國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃HapMap Project 網(wǎng)頁(yè)中(http//：www.hapmap.org)下載有關(guān)45個(gè)獨(dú)立的中國(guó)漢族北京居民 KCNE2和KCNE3基因的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行SNP標(biāo)簽的選取。按照次等位基因頻率>0.15，最小連鎖不平衡相關(guān)程度(r2)值>0.8使用Haploview 軟件(https：//sourceforge.net/projects/haploview/)進(jìn)行標(biāo)簽 SNP 的篩選。最終選擇了符合標(biāo)準(zhǔn)的KCNE3基因rs9516、rs10898993、rs3867279位點(diǎn)和KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)與新疆漢族老年人進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1患者外周血DNA的提取 外周血(ACD 抗凝采血管采集)DNA 的提取采用上海生工生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的磁珠法 DNA 提取試劑盒。

1.3.2實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì) 引物采用Peimer6.0自行設(shè)計(jì)后送上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表2。

表2 KCNE2和KCNE3 基因的SNP位點(diǎn)引物

1.3.3聚合酶鏈反應(yīng)體系(PCR) PCR反應(yīng)總體系為25 μl，其中DNA模板1 μl，10×Taq緩沖液(Takara) 2.5 μl，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.3 μl，上下游引物各1 μl，10 mmol/L氯化鎂(MgCl2) 1 μl，Taq DNA聚合酶0.1 μl，去離子水11 μl。按順序依次加入后混勻。PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃×4 min；變性：95℃×20 s，退火：58℃×30 s，延伸：72℃×30 s，30個(gè)循環(huán)；最后延伸：72℃×5 min；10℃保存。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)AF組和對(duì)照組基因型、等位基因頻率的比較及判斷是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗(yàn)；采用SHEsis在線軟件(網(wǎng)址為http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php.) 進(jìn)行連鎖不平衡分析和單倍型分析；運(yùn)用廣義多因子降維(GMDR)軟件對(duì)4個(gè) SNPs 位點(diǎn)進(jìn)行交互作用分析，選擇最佳基因交互作用模型；采用MDR軟件畫出各SNP位點(diǎn)交互作用樹(shù)狀圖節(jié)點(diǎn)圖，確定其交互作用是拮抗還是協(xié)同作用，并找出高危和低?；蛐徒M合。

2 結(jié) 果

2.1各位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) rs9984281位點(diǎn)僅在AF組不符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，rs9516、rs10898993、rs3867279位點(diǎn)AF組和對(duì)照組均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(n，n=251)

2.2各位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率分布及與老年AF的關(guān)聯(lián)性 502例漢族人群中KCNE3基因rs9516、rs10898993位點(diǎn)存在(AA，AG，GG)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；rs3867279位點(diǎn)存在(CC，CT，TT)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CT、TT基因型和T等位基因可降低老年人AF發(fā)生危險(xiǎn)性。KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)存在(AA，AG，GG)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布及與老年AF的關(guān)聯(lián)性〔n(%)，n=251〕

2.3多因子降維法(MDR)分析 對(duì)KCNE3基因rs9516、rs10898993、rs3867279位點(diǎn)及KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)進(jìn)行MDR分析，基因交互作用結(jié)果見(jiàn)表5，四種模型中三種模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因?yàn)閮梢蜃幽Ｐ偷臋z驗(yàn)樣本精確度最高0.620 1，交叉驗(yàn)證一致性為10/10，檢驗(yàn)樣本精確度與交叉驗(yàn)證一致性值越大說(shuō)明模型越好，故兩因子模型為最佳模型，且P=0.001 0，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明這兩個(gè)SNP位點(diǎn)的交互作用與老年AF的發(fā)生可能相關(guān)聯(lián)。

圖1為各SNP位點(diǎn)交互作用的樹(shù)狀圖，從其顏色可判斷KCNE3基因rs10898993位點(diǎn)與KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)之間存在較強(qiáng)的正交互作用，即協(xié)同作用，其他位點(diǎn)之間交互作用不明顯。圖2為KCNE3基因rs10898993位點(diǎn)與KCNE2基因rs9984281位點(diǎn)不同基因型組合方式對(duì)老年人AF發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，圖中深灰色的方格代表高?；蛐徒M合，淺灰色的方格代表低?；蛐徒M合，每個(gè)格子中左側(cè)柱代表的是具有此種基因型組合的患有AF的老年人例數(shù)，右側(cè)柱子代表的是正常老年人例數(shù)?？梢?jiàn)rs10898993位點(diǎn)和rs9984281位點(diǎn)所組成的AA/AA、AG/AG、GG/AG和GG/GG基因型組合為高?；蛐徒M合，AG/AA、GG/AA、AG/AA、AA/GG和AG/GG基因型組合為低?；蛐徒M合。

表5 基因交互作用最佳模型

圖1 各基因SNP位點(diǎn)交互作用

圖2 rs10898993和rs9984281交互模型高危和低?；蛐偷姆植?/p>

3 討 論

AF是臨床實(shí)踐中最常見(jiàn)的心律失常，大多數(shù)AF患者患有冠心病、心臟瓣膜病、高血壓或左心室功能不全〔9〕。然而，10%～30%的AF患者在沒(méi)有任何已知危險(xiǎn)因素的情況下發(fā)生AF。研究已經(jīng)確定了大量家系中一系列通道基因的突變，這種結(jié)果表明AF的發(fā)展和維持存在遺傳傾向〔10〕。

SNP是人類基因組上最常見(jiàn)的單個(gè)核苷酸的變異，對(duì)了解和認(rèn)識(shí)復(fù)雜遺傳性狀有重要作用。通過(guò)確定基因SNP位點(diǎn)分型與疾病相關(guān)性，對(duì)認(rèn)識(shí)疾病的遺傳易感性和鑒定疾病的致病基因有重要作用〔11，12〕。如某些突變位點(diǎn)的基因型在特定地域和特定種族人群中表達(dá)有很大差異，或在不同種族中等位基因型和基因頻率差異性顯著。如李琳等〔13〕研究表明漢、維吾爾族人群血管緊張素原等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(χ2=14.742，P<0.001)。另一項(xiàng)研究選擇了構(gòu)成電壓門控(Kv)鉀通道的調(diào)節(jié)基因：KCNE2和KCNE3基因，結(jié)果表明KCNE2和KCNE3基因的5個(gè)位點(diǎn)在新疆漢族和維吾爾族AF患者中基因型和等位基因分布頻率比較差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔14〕。KCNE蛋白家族KCNE1-KCNE5構(gòu)成Kv鉀通道的調(diào)節(jié)劑，并且其中KCNE1和KCNE3已被證明參與心律失?！?5〕。KCNE1突變可能導(dǎo)致Jervell和Lange-Nielsen疾病，編碼minK相關(guān)肽(MiRP)1的KCNE2突變與藥物誘導(dǎo)的心律失常，長(zhǎng)QT綜合征(功能喪失表型)和AF(功能獲得表型)有關(guān)〔16，17〕。KCNE蛋白是100～200個(gè)氨基酸的多肽鏈。它們均包含一個(gè)細(xì)胞外N端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)假定的跨膜區(qū)段和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)C端。這些不同的結(jié)構(gòu)修飾不同的K+通道的功能〔18〕。KCNE1蛋白質(zhì)minK賦予IKs特征性緩慢激活。單個(gè)KCNE蛋白與K+離子通道α-亞基之間的相互作用不是特異性的。因此，minK與KCNQ1和心臟鉀離子通道(HERG)相互作用，而KCNE1-3蛋白與Kv3.1和Kv3.2相互作用，導(dǎo)致通道門控鉀通道多樣化〔19〕。其他通道也與KCNE蛋白相互作用，但這種相互作用在體內(nèi)的功能意義尚未闡明。研究表明，所有KCNE基因均在心臟中表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)離子通道功能及心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的形成具有非常重要的作用〔20〕。不同KCNE基因之間的平衡對(duì)Kv通道具有不同影響的KCNE蛋白可以實(shí)現(xiàn)IKs和其他K+電流的可變調(diào)節(jié)。本研究的結(jié)果證明了AF患者中鉀通道基因的重要作用，但AF患者的分子缺陷和細(xì)胞機(jī)制仍有待研究。Yang 等〔21〕收集了28個(gè)不相關(guān)中國(guó)家族AF患者資料，并對(duì)8個(gè)鉀通道基因(KCNQ1，HERG，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE4，KCNE5和KCNJ2)進(jìn)行了測(cè)序。在兩個(gè)家族中發(fā)現(xiàn)KCN2的第27位(R27C)的精氨酸-半胱氨酸突變和負(fù)責(zé)背景鉀電流的KCNQ1-KCNE2通道的β亞基。這兩個(gè)家族中的所有受影響成員都存在突變。與KCNQ1 S140G相似，該突變對(duì)KCNQ1-KCNE2通道具有功能獲得效應(yīng)；與長(zhǎng)QT綜合征相關(guān)的KCNE2突變不同，它不會(huì)改變HERG-KCNE2電流。該突變也沒(méi)有改變HCN通道家族的功能。因此，KCNE2 R27C是與AF的起始和(或)維持相關(guān)的功能獲得突變。人KCNE3基因內(nèi)的突變與早發(fā)孤立性和家族性AF有關(guān)。AF的心律失常發(fā)展可能涉及KCNE3和相關(guān)Kv通道亞基的異向心房Kv通道電流的內(nèi)在心肌破壞〔22，23〕。目前AF發(fā)生和維持的機(jī)制尚未完全闡明，鉀離子通道基因多態(tài)性與AF的發(fā)生和進(jìn)展有相關(guān)性，這已經(jīng)成為AF機(jī)制研究新的切入點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)手段和技術(shù)的日新月異，與AF相關(guān)的基因和位點(diǎn)將會(huì)被更多的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步通過(guò)位點(diǎn)或基因的聯(lián)合分析，為不同種族和地區(qū)AF的治療提供新思路、新靶點(diǎn)。