張紅

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430022)

肝癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病因素較多〔1，2〕。治療手段仍以手術(shù)為主，同時(shí)結(jié)合放化療綜合治療，但手術(shù)有不完全、易復(fù)發(fā)的隱患，放化療會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)其不敏感性，難以清除癌細(xì)胞〔3〕。近些年出現(xiàn)的以中藥為主中西醫(yī)結(jié)合治療的方式對(duì)肝癌的治療有較好療效〔4〕。中藥有直接殺傷癌細(xì)胞、抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)體免疫、預(yù)防肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和病變等作用〔5〕。連翹三萜類化合物具有抗菌消炎、抗癌、抗病毒和抗氧化等作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)連翹乙醇提取物可以抑制BGC-823細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用〔7〕。連翹三萜類化合物樺木酸能通過(guò)誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生〔8〕。連翹三萜類化合物安博立酸通過(guò)使細(xì)胞阻滯于S期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)〔9〕。連翹三萜類化合物達(dá)瑪-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇(DM)也能抑制人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔10〕。本研究擬分析連翹三萜類化合物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響及其可能的作用機(jī)制，為肝癌的預(yù)防和藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)(美國(guó)Gibco)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara)；PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)；Taq DNA Polymerase、AceQ qPCR SYBR?Green Mix(南京vazyme)；細(xì)胞板、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、硅膠層析柱(賽默飛公司)；LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)；Western印跡試劑盒(上海信裕生物技術(shù)有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒(上海碧云天)；倒置顯微鏡(美國(guó)Olympus)；Co60醫(yī)療照射裝置(中國(guó)核動(dòng)力研究院)。

1.2連翹三萜類化合物DM的提取 參考孫婧等〔10〕方法，將干燥的連翹果實(shí)粉碎，于95%的乙醇中浸泡成膏，再用乙酸乙酯萃取，然后用硅膠層析柱層析，最后用石油醚和乙酸乙酯混合液分次洗脫即可。所得混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，再真空干燥箱40℃過(guò)夜，粉末狀保存。以50 nmol/L的濃度溶于二甲基亞砜(DMSO)中保存，使用時(shí)按所需濃度按比例稀釋。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，含5% CO2恒溫箱培養(yǎng)。每2～3 d傳代一次。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 參考孫婧等〔10〕的研究方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后，接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸去原培養(yǎng)液，換成不同濃度DM(0、25、50、75、100 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。取常規(guī)培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞消化后接種于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-己糖激酶(HK)2組(轉(zhuǎn)染si-HK2)、DM+pcDNA組(DM 75 μmol/L處理+轉(zhuǎn)染pcDNA)、DM+pcDNA-HK2組(DM 75 μmol/L處理+轉(zhuǎn)染pcDNA-HK2)，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.5MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖 取各組細(xì)胞培養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后，每孔加入20 μl質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT試劑，繼續(xù)孵育4 h，加入150 μ DMSO，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處OD值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔取均值，將對(duì)照組細(xì)胞抑制率設(shè)定為0%。其余各組細(xì)胞抑制率(%)=(空白對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.6qRT-PCR分析HK2 mRNA表達(dá)水平 按照Trizol說(shuō)明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR方法擴(kuò)增。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.7Western印跡檢測(cè)HK2蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白上樣量60 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min；再加入相對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，暗室中顯影，定影。采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞消化后，以合適密度接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞融合達(dá)到80%左右，分為對(duì)照組、DM組、si-NC組、si-HK2組、DM+pcDNA組、DM+pcDNA-HK2組，DM組、DM+pcDNA組、DM+pcDNA-HK2組分別加入75 μmol/L的DM，其余組不加藥，加藥24 h后，以上各組分別給予0、2、4、6、8 Gy的60Co醫(yī)療裝置照射。照射后，按照射劑量大小分別以0.3×103、1×103、1×103、3×103、3×103的細(xì)胞密度接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d。PBS清洗2遍后甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落?？寺⌒纬陕?PE)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)(SF)=照射劑量組的集落數(shù)/(該組細(xì)胞接種數(shù)×未照射組PE)。采用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，SF=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D為照射劑量(Gy)，D0為平均致死劑量，Dq為準(zhǔn)閾劑量(代表存活的寬肩度)，N為外推值。放射增敏比(SER)=單純照射組D0/加藥聯(lián)合照射組D0。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同DM濃度對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，用不同濃度DM處理肝癌HepG2細(xì)胞后，于24、48、72 h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖，肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率隨著DM濃度的升高而逐漸顯著升高(P<0.05)。選用作用時(shí)間48 h，抑制率為50%左右的濃度(75 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制率的影響

2.2DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組〔(6.79±0.58)%〕，DM組中HepG2細(xì)胞凋亡率〔(23.49±2.14)%〕顯著升高(t=13.046,P=0.000)。

2.3DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞放療敏感性的影響 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)單擊多靶模型擬合計(jì)算得出，在HepG2細(xì)胞中對(duì)照組和DM組D0值分別是2.531、1.353，Dq為1.848，0.739 Gy，N為2.075、1.726，DM組SER是1.870。細(xì)胞的存活擬合曲線如圖1所示，在同一劑量照射下，DM聯(lián)合照射組的存活率明顯小于單純照射對(duì)照組，細(xì)胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量的增加，曲線下移的趨勢(shì)呈現(xiàn)直線型?？梢?jiàn)，DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有輻射增敏作用。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05圖1 不同劑量照射后HepG2細(xì)胞的存活曲線

2.4DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中HK2表達(dá)的影響 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組HK2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組HK2 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 HK2蛋白表達(dá)

表2 DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中HK2表達(dá)的影響

2.5抑制HK2表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-HK2組HK2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，si-HK2組HepG2細(xì)胞抑制率和凋亡率顯著高于si-NC組(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖3。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)單擊多靶模型擬合計(jì)算得出，在HepG2細(xì)胞中si-NC組和si-HK2組D0值分別是2.596、1.452，Dq為1.888、0.775 Gy，N為2.069、1.705，si-HK2組SER是1.788。細(xì)胞的存活擬合曲線如圖4顯示，在同一劑量照射下，si-HK2聯(lián)合照射組的存活率明顯小于單純照射si-NC組，細(xì)胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量的增加，曲線下移的趨勢(shì)呈現(xiàn)直線型。

表3 抑制HK2表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖3 HK2蛋白表達(dá)

與si-NC組比較：1)P<0.05圖4 不同劑量照射后HepG2細(xì)胞的存活曲線

2.6HK2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及放療敏感性的作用 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組HK2蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；相較于DM+pcDNA組，DM+pcDNA-HK2組HK2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組HepG2細(xì)胞抑制率顯著升高(P<0.05)；相較于DM+pcDNA組，DM+pcDNA-HK2組HepG2細(xì)胞抑制率顯著降低(P<0.05)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DM組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；相較于DM+pcDNA組，DM+pcDNA-HK2組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表4。

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)單擊多靶模型擬合計(jì)算得出，在HepG2細(xì)胞中對(duì)照組和DM組D0值分別是2.612、1.424，Dq為1.959、0.706 Gy，N為2.117、1.642；DM+pcDNA組和DM+pcDNA-HK2組D0值分別是1.285、2.061，Dq為0.769、1.666 Gy，N為1.819，2.244，DM組SER為1.834，DM+pcDNA-HK2組為0.624。細(xì)胞的存活擬合曲線如圖6顯示，在同一劑量照射下，DM聯(lián)合照射組的存活率明顯小于單純照射對(duì)照組，細(xì)胞的存活曲線明顯下移；且隨著照射劑量的增加，曲線下移的趨勢(shì)呈現(xiàn)直線型。而在同一劑量照射下，DM+pcDNA-HK2聯(lián)合照射組的存活率明顯小于DM+pcDNA照射組，細(xì)胞的存活曲線明顯上移；且隨著照射劑量的增加，曲線上移的趨勢(shì)更加明顯(均P<0.05)。

圖5 HK2蛋白表達(dá)

表4 HK2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的作用

圖6 不同劑量照射后HepG2細(xì)胞的存活曲線

3 討 論

肝癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病〔11〕。中醫(yī)藥在肝癌的治療中具有重要作用，中藥主要通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、直接殺傷癌細(xì)胞、抑制端粒酶活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腫瘤血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性等方面達(dá)到治療肝癌的目的〔12〕。DM是從連翹中分離出的一種三萜類化合物〔13〕。研究發(fā)現(xiàn) DM可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡，抑制其細(xì)胞端粒酶活性，增加癌細(xì)胞的放療敏感性〔14〕。 DM可促進(jìn)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞周期中G1期的比例，還有放療增敏作用〔15〕。謝麗等〔16〕研究也證明DM能阻滯細(xì)胞S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)連翹可抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)〔17〕。連翹醇提物對(duì)胃癌、肝癌、肺癌和大腸癌均有抗腫瘤效應(yīng)，還能下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Survivin和Bcl-2 mRMA的表達(dá)〔18〕。

HK2是糖降解途徑第一步反應(yīng)的限速酶，研究證明在多種腫瘤中高表達(dá)，給腫瘤的生長(zhǎng)提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)〔19〕。有研究表明HK2蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，可作為預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物〔20〕。HK2在肝癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔21〕。 HK2的活化與乙肝病毒感染的肝癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)〔22〕。沉默HK2可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，增加乳腺癌對(duì)放射治療的敏感性〔23〕。HK2高表達(dá)增強(qiáng)放射治療抵抗性，導(dǎo)致宮頸鱗癌預(yù)后不良〔24〕。HK2在卵巢癌組織〔25〕、鼻咽癌〔26〕、結(jié)直腸癌〔27〕、胃癌〔28〕中上調(diào)表達(dá)，可預(yù)測(cè)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及預(yù)后。缺氧條件下，食管鱗癌中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α及HK2表達(dá)升高，HIF-1α可能通過(guò)HK2影響細(xì)胞糖酵解水平〔29〕。shRNA干擾HK2基因的表達(dá)可抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素(DOX)的敏感性〔30〕。

一些中藥能夠影響HK的活性，進(jìn)而影響腫瘤的增殖。研究發(fā)現(xiàn)健脾化瘀解毒中藥復(fù)方胃痞消能降低糖酵解酶HK2的活性〔31〕。而桑葉各有效部位可提高肝臟細(xì)胞HK的活性〔32〕。蟾蜍靈通過(guò)降低HK2的表達(dá)進(jìn)而降低宮頸癌細(xì)胞的糖代謝水平，從而抑制細(xì)胞增殖〔33〕。氧化苦參堿明顯降低HK的活性，通過(guò)干擾HepG2細(xì)胞能量代謝來(lái)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔34〕。小豆蔻明能增強(qiáng)HK活性，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下細(xì)胞的糖代謝，抑制高糖高胰島素刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖〔35〕。雷公藤紅素能降低胃癌細(xì)胞SGC-7901和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304中HK、乳酸脫氧酶(LDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)的活力，導(dǎo)致能量不足，抑制細(xì)胞增殖，從而達(dá)到抗腫瘤作用〔36〕。香加皮提取物杠柳苷能顯著抑制糖酵解HK-2基因的表達(dá)而抑制急性淋巴細(xì)胞白血病的生長(zhǎng)〔37〕。本研究發(fā)現(xiàn)，DM及HK2抑制表達(dá)均能下調(diào)HK2的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在同一劑量照射下，DM、si-HK2聯(lián)合照射組的存活率低，對(duì)增強(qiáng)了癌細(xì)胞的放療敏感性。HK2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了DM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制、凋亡促進(jìn)及輻射增敏作用。