何愛琳，李文桂，梁誠誠

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016)

銅綠假單胞菌(Pa)是一種機(jī)會性病原體，在人體可引起多種疾病。該菌常與院內(nèi)感染有關(guān)，尤其在免疫功能低下的患者中易致病，常引起肺炎、尿路感染和菌血癥等[1]。Pa具備明顯的抗菌能力，可通過其內(nèi)在和獲得性的耐藥機(jī)制來對抗大多數(shù)抗菌藥物，造成多重耐藥株和完全耐藥株的產(chǎn)生，對免疫受損者和住院患者構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2-3]。有學(xué)者對2006—2016年臨床分離的Pa菌株進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果顯示多重耐藥Pa感染的患者其病死率高達(dá)44.6 %，是導(dǎo)致患者死亡的最大風(fēng)險因素之一[4]。若Pa感染未及時控制，將給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有對抗Pa感染的新療法包括注射疫苗，使用噬菌體、益生菌、抗菌肽及毒力抑制劑等[5]，其中疫苗可有效減少特定病原體的數(shù)量，從而改善抗菌藥物耐藥性，是防治Pa感染的重要手段之一[6]。膜蛋白PopB是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)轉(zhuǎn)運蛋白的組成成分之一，利用該系統(tǒng)能將效應(yīng)蛋白注入真核細(xì)胞內(nèi)，從而抑制宿主細(xì)胞的免疫功能，引發(fā)感染[7-8]。RAO等[9]用PopB蛋白可誘導(dǎo)Pa感染的囊性纖維化患者產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，提示其具有抗原性，是一種新型的治療Pa感染候選疫苗分子。本研究擬將PopB基因插入表達(dá)載體pGEX-1λT，構(gòu)建pGEX-PopB，并研究該重組質(zhì)粒在大腸埃希菌的表達(dá)效率，從而為Pa疫苗的研制提供有價值的資料。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株和宿主菌 pGEX-1λT、Pa的PA01標(biāo)準(zhǔn)株和大腸埃希菌BL21(DE3)由本所保存。

1.2主要試劑 UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、UNIQ-1柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑及考馬斯亮藍(lán)試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4 DNA連接酶和DNA標(biāo)記物購自美國 Fermentas公司；LB液體和固體培養(yǎng)基由本所制備；中相對分子質(zhì)量蛋白購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京鼎今生物科技有限公司；Pa感染的鼠血清由本所保存。

1.3方法

1.3.1PopB基因的擴(kuò)增及鑒定 根據(jù)PopB基因的DNA序列和載體pGEX-1λT的特點設(shè)計1對引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。P1(上游引物)：5′-GCGGATTC-TTT GGA TCC ATG AAT CCG ATA ACG CTT G-3′；P2(下游引物)：5′-GCGAATTC-TTT GAA TTC TCA GAT CGC TGC CGG TCG-3′。5′端處分別引入BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位點。按照細(xì)菌基因組抽提試劑盒的說明書抽提Pa DNA。以提取的DNA為模板，P1和P2為引物，PCR擴(kuò)增PopB基因。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃再次延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.3.2重組質(zhì)粒pGEX-PopB的構(gòu)建及鑒定 將PopB的擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pGEX-1λT用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，并按照純化試劑盒說明書對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化。酶切體系共60 μL：42.0 μL的PCR產(chǎn)物或載體，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ各1.3 μL，6.0 μL的10×Tango緩沖液，9.4 μL的滅菌去離子水。置37 ℃水浴2 h；將載體和PopB基因片段按比例約1∶5混合，并在T4 DNA連接酶作用下建立連接體系，共20 μL：13 μL的載體片段，3 μL的PopB基因片段，T4 DNA連接酶和10×T4 Buffer各2 μL。置4 ℃連接過夜后70 ℃水浴10 min；將連接產(chǎn)物電穿孔轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)BL21(DE3)，37 ℃ 150 r/min振搖培養(yǎng)1 h后接種于含氨芐西林(50 μg/mL)的溶菌肉湯(LB)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。在培養(yǎng)基中挑取單菌落后加入同上述濃度氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min振搖培養(yǎng)72 h后抽提質(zhì)粒，按上述酶切體系雙酶切，并以提取的質(zhì)粒為模板，按上述PCR條件擴(kuò)增PopB基因。分別對酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3pGEX-PopB在大腸埃希菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)、分析及鑒定 將含有重組質(zhì)粒pGEX-PopB的菌液振搖培養(yǎng)至600 nm波長處吸光度值為0.5～0.8，取適量作為未誘導(dǎo)對照，剩余菌液加入IPTG(1 mmol/L)，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，分別在1、3、5、7、9、11、13 h收集菌液，5 000 r/min離心2 mim，棄上清液，分別吸取50 μL的上樣緩沖液和20 μL的菌液，將其混合后煮沸5 min，吸取20 μL樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)試劑染色后脫色至凝膠透明、條帶清晰，BIO-RAD凝膠成像儀分析重組蛋白表達(dá)量。SDS-PAGE電泳后，切下蛋白標(biāo)記物，考馬斯亮藍(lán)試劑染色約1 h后脫色，余下凝膠150 mA恒流電轉(zhuǎn)膜2 h，取出NC膜，封閉液封閉2 h，PBS漂洗3次；加入一抗(1∶100稀釋的Pa感染鼠血清)，室溫轉(zhuǎn)搖封閉2 h，PBS漂洗3次；加入二抗(1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG)，室溫孵育2 h，PBS漂洗3次；加入新配制的DAB顯色劑避光反應(yīng)10～15 min，用雙蒸水洗膜終止反應(yīng)并成像。

2 結(jié) 果

2.1PopB基因的鑒定 以PA01標(biāo)準(zhǔn)株的DNA為模板，擴(kuò)增獲得1 200 bp的PopB基因片段，見圖1。

注：M為DNA 標(biāo)記物；1～7為PopB基因的PCR產(chǎn)物。圖1 PopB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

2.2重組質(zhì)粒pGEX-PopB的酶切鑒定 重組質(zhì)粒用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切分別獲得4 947 bp的pGEX-1λT載體片段和1 200 bp的PopB基因片段，見圖2。

注：M為DNA 標(biāo)記物；1、2為pGEX-1λT；3、4為重組質(zhì)粒pGEX-PopB雙酶切產(chǎn)物。圖2 pGEX-PopB的雙酶切鑒定

2.3重組質(zhì)粒pGEX-PopB的PCR鑒定 從具有氨芐西林抗性的重組菌中提取質(zhì)粒，并以該質(zhì)粒為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得1 200 bp的PopB基因片段，見圖3。

注：M為DNA 標(biāo)記物；1～4為重組質(zhì)粒pGEX-PopB的PCR產(chǎn)物。圖3 重組質(zhì)粒pGEX-PopB的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

2.4重組質(zhì)粒pGEX-PopB在大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 重組質(zhì)粒pGEX-PopB轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示其蛋白表達(dá)量約為66×103。BIO-RAD凝膠成像儀提示PopB融合蛋白占全菌總量的20%，在IPTG誘導(dǎo)3～5 h時其表達(dá)量較高，而未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌無此條帶，見圖4。

注：M為中相對分子質(zhì)量蛋白標(biāo)記物；1為未誘導(dǎo)的重組菌；2～8為分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1、3、5、7、9、11、13 h的重組菌。圖4 重組菌pGEX-PopB表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.5Western blot鑒定 將大腸埃希菌表達(dá)的PopB蛋白與Pa感染的鼠血清做Western blot，在相對分子質(zhì)量為66×103M處有一特異性反應(yīng)條帶，而非誘導(dǎo)的重組菌無此條帶，見圖5。

注：M為中相對分子質(zhì)量蛋白標(biāo)記物；1為未誘導(dǎo)對照組；2為PopB蛋白與Pa感染鼠血清反應(yīng)Western blot結(jié)果。圖5 重組菌pGEX-PopB表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定

3 討 論

PopB蛋白是T3SS中高度保守的成分之一，也是公認(rèn)的毒力因子之一[10]。研究證實，用純化的重組PopB蛋白免疫小鼠能誘導(dǎo)IgG特異性抗體的產(chǎn)生，并且對致命的Pa感染可產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用，表明PopB具有免疫原性，是極具研究價值的疫苗分子之一[11]。WU等[12]以PA01株基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增PopB基因，克隆至載體pET-28b構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)約40×103的重組His-PopB蛋白，用該蛋白免疫小鼠可誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗Pa感染的保護(hù)力。本研究以PA01株DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得1 200 bp的PopB基因片段，構(gòu)建了pGEX-PopB重組質(zhì)粒，為研究載體pGEX-1λT表達(dá)的融合蛋白打下了基礎(chǔ)。

大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。BL21具有易于培養(yǎng)、遺傳背景明確、成本低、生長速度快及可表達(dá)各種外源基因等優(yōu)點，是生產(chǎn)重組蛋白常用的表達(dá)菌株之一。pGEX載體可用于構(gòu)建高水平表達(dá)的目的基因片段，其中pGEX-1λT是以大腸埃希菌為宿主，并且能高效表達(dá)融合蛋白的載體之一。pGEX-1λT多克隆位點的上游包含有表達(dá)26×103蛋白的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因片段。GST能提高外源蛋白穩(wěn)定性和可溶性，同時又保留蛋白的抗原性和生物活性。帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白能通過特定的目的基因插入pGEX-1λT的多克隆位點，其上含有l(wèi)aclq基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物可作為抑制劑結(jié)合在tac啟動子的操縱子區(qū)，加入誘導(dǎo)劑IPTG后，目的基因能在tac啟動子的調(diào)控下高效表達(dá)目的蛋白。劉瀟等[13]將OprI基因插入pGEX-1λT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-OprI，再將該質(zhì)粒導(dǎo)入BL21中可成功表達(dá)Pa的目的蛋白。

本研究采用的電穿孔技術(shù)是分子生物學(xué)中質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸埃希菌常用的方法之一。該技術(shù)由于操作簡單快捷，轉(zhuǎn)化效率高，已廣泛應(yīng)用于原核細(xì)胞外源生物分子的導(dǎo)入。用于電穿孔的BL21感受態(tài)是由37 ℃培養(yǎng)的細(xì)菌所制備，轉(zhuǎn)化效率達(dá)108～109cfu/μg DNA。通過EP技術(shù)可誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的分泌，促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-8和IL-17等，同時可增加轉(zhuǎn)化生長因子水平，提高自然殺傷細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集，起到類似于佐劑的作用，從而增強免疫效應(yīng)。EP可明顯提高基于質(zhì)粒DNA編碼的免疫原性蛋白的表達(dá)，在疫苗或基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。已報道電穿孔技術(shù)輔助的DNA疫苗在登革熱、艾滋病和埃博拉病毒病等動物模型中誘導(dǎo)了理想的保護(hù)性免疫反應(yīng)[14-16]。

4 結(jié) 論

本研究在成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-PopB基礎(chǔ)上，采用電穿孔轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)與預(yù)期結(jié)果相符的融合蛋白，該融合蛋白占菌體總量的20 %，且在誘導(dǎo)3～5 h時表達(dá)量達(dá)較高水平。Western blot證實該融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特異識別，表明重組蛋白具有一定的免疫原性，為Pa疫苗的進(jìn)一步研制奠定了良好的基礎(chǔ)。