鄒瑟音，周 念，黃文秀，凌連生，曹東林，雷 達(dá)

(1.廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 518037；2.中山大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510275)

過氧化物酶是一類以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的氧化還原酶，它們能催化很多反應(yīng)，大部分的過氧化物酶都由植物、真菌或細(xì)菌產(chǎn)生，如辣根過氧化物酶(HRP)、木質(zhì)素過氧化物酶、酵母細(xì)胞色素C過氧化物酶等[1-5]，它們被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目的檢測，是試劑盒顯色體系中的關(guān)鍵成分。然而，天然過氧化物酶屬于蛋白，在實(shí)際應(yīng)用中也存在許多不足，隨著納米醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究者致力于尋找或設(shè)計(jì)出可替代天然過氧化物酶的材料，如納米模擬酶，指模擬具有天然過氧化物酶的特定催化活性的納米材料，它們既具備天然過氧化物酶的優(yōu)良催化活性，又彌補(bǔ)了天然過氧化物酶的各種不足，可應(yīng)用于各種物質(zhì)的檢測。AMOURIZI等[6]通過化學(xué)還原法合成具有過氧化物酶活性的金納米粒子PVA-GNPs，可通過比色法進(jìn)行氟離子(F-)、溴離子(Br-) 和碘離子(I-) 等負(fù)離子的檢測。WU等[7]通過簡單而高效的方法合成的氧化亞銅(Cu2O)納米粒子表現(xiàn)出極高的類過氧化物酶活性，可應(yīng)用于檢測葡萄糖和膽固醇。SHI等[8]的研究利用二價(jià)銅離子和氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，在堿性條件下合成的納米復(fù)合材料展現(xiàn)出來的類過氧化物酶活性遠(yuǎn)高于純Cu2O 納米粒子和天然過氧化物酶POx，且該研究基于尿酸酶建立了一種用于微量尿酸檢測的化學(xué)發(fā)光法。本研究自行設(shè)計(jì)合成具有氫鍵超分子結(jié)構(gòu)的鈀納米粒子復(fù)合物(MCA-Pd NPs)，并應(yīng)用到尿酸檢測中，以初步探討其對臨床血清標(biāo)本中尿酸進(jìn)行檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 5份血清標(biāo)本均來自廣東省第二人民醫(yī)院門診及住院患者，3 000 r/min離心5 min，2 h內(nèi)檢測。

1.2儀器與試劑 30%過氧化氫(H2O2)溶液購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三聚氰胺(C3N6H6)、三聚氰酸(C3H3N3O3)購自比利時(shí)Acros Organics公司，無水檸檬酸(C6H8O7)、無水乙酸鈉(CH3COONa)、醋酸(CH3COOH)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；氯化鈀(PdCl2)、2，2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻挫啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS2-)購自上海生工生物工程有限公司；濃鹽酸購自廣州化學(xué)試劑廠；尿酸標(biāo)準(zhǔn)品購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；HRP購自Sigma公司；尿酸酶購自上海瓦蘭生物科技有限公司；試驗(yàn)過程中所用的水皆為超純水，且所用試劑均為分析純。UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì)購自日本島津公司；GZX-9146數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)購自美國Beckman Coulter公司； B-260恒溫水浴鍋購自上海亞榮生化儀器廠；85-2型恒溫磁力攪拌器購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子天秤購自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；日立7600生化分析儀及配套試劑購自北京利德曼生化股份有限公司。

1.3方法

1.3.1MCA-Pd NPs的合成 在洗凈、烘干的150 mL的燒杯中加入10 mL的C3N6H6溶液，不斷攪拌情況下，同時(shí)再將0.4 mL的50 mmol/L H2PdCl4加入上述C3N6H6溶液中；然后，將10 mL的10 mmol/L C3H3N3O3加入上述混合液中；最后，在混合液中加入0.8 mL的50 mmol/L C6H8O7。可以觀察到混合液中開始出現(xiàn)黃色沉淀物，在室溫下持續(xù)攪拌12 h后，即可合成具有氫鍵超分子結(jié)構(gòu)的MCA-Pd NPs，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2比色分析 所有標(biāo)本的比色分析均使用UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)完成，每一批檢測都同時(shí)設(shè)置空白管作為參比溶液，在參比池和測試池中同時(shí)放置參比溶液對儀器進(jìn)行基線校正，然后依次將樣品放入測試池中進(jìn)行檢測，記錄吸光度值。

1.3.3尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 準(zhǔn)確稱取適量的尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容至刻度，充分搖勻，此溶液為5 mmol/L尿酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于 4 ℃保存；臨用前，將尿酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液用超純水稀釋至1 mmol/L，此為尿酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。分別用超純水稀釋配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的尿酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。進(jìn)行比色分析，每個(gè)水平重復(fù)測定3次，取吸光度值的均值為縱坐標(biāo)，以尿酸水平(μmol/L)為橫坐標(biāo)，繪制尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.3.4臨床標(biāo)本檢測 5份臨床血清標(biāo)本分別用本試驗(yàn)建立的尿酸檢測體系和日立7600生化分析儀進(jìn)行尿酸水平檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.5MCA-Pd NPs的穩(wěn)定性檢測 新合成的MCA-Pd NPs放置于室溫，用反應(yīng)體系20 μL 1 mmol/L H2O2+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL ABTS2-，每隔5 d檢測一次酶活性，比色法檢測吸光度值越高說明酶活性越強(qiáng)，連續(xù)檢測6次共30 d。

1.3.6尿酸檢測體系的建立 參考常用于尿酸檢測的尿酸酶-過氧化物酶偶聯(lián)法，為了檢測MCA-Pd NPs在尿酸檢測體系中發(fā)揮過氧化物酶的催化作用，應(yīng)用HRP作為參照在室溫條件下設(shè)計(jì)了如下試驗(yàn)：(1)a管，10 μL 蒸餾水+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 2 000 U/L HRP+50 μL 90 mmol/L ABTS2-；(2)b管，10 μL 310 μmol/L 尿酸+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 2 000 U/L HRP+50 μL 90 mmol/L ABTS2-；(3)c管，10 μL 310 μmol/L 尿酸+50 μL 1.6 g/L 尿酸酶+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL 90 mmol/L ABTS2-；(4)d管，50 μL 蒸餾水+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL 90 mmol/L ABTS2-。

1.3.7尿酸檢測體系條件優(yōu)化 (1)MCA-Pd NPs和ABTS2-用量的確定，為保證反應(yīng)體系中MCA-Pd NPs和ABTS2-足量，但同時(shí)不能浪費(fèi)材料，先同時(shí)固定H2O2溶液(1 mmol/L)和ABTS2-(90 mmol/L)的用量分別為20 μL和80 μL，各反應(yīng)管加入不同體積的MCA-Pd NPs(20、40、80、160、250 μL)，在420 nm波長處檢測吸光度值；接著固定H2O2溶液(1 mmol/L)和MCA-Pd NPs(0.105 mg/mL)，用量分別為20 μL 和100 μL，各反應(yīng)管加入不同體積的ABTS2-(10、20、40、80、120 μL)，在420 nm波長處檢測吸光度值。(2)反應(yīng)溫度和時(shí)間的確定，為確定最佳反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)如下試驗(yàn)：4管混合液(10 μL 310 μmol/L尿酸標(biāo)準(zhǔn)品+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL 90 mmol/L ABTS2-)分別在室溫25 ℃、水浴鍋37 ℃、水浴鍋42 ℃、水浴鍋50 ℃反應(yīng)30 min，對它們在420 nm下的吸光度值進(jìn)行測定分析。通過設(shè)計(jì)以下試驗(yàn)來確定體系的最佳反應(yīng)時(shí)間：10 μL 300 μmol/L尿酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液+50 μL 1.6 g/L尿酸酶+ 100 μL 0.105 mg/mL MCA-Pd NPs+50 μL ABTS2-，共5管反應(yīng)管混勻，于37 ℃分別反應(yīng)5、10、20、30、40 min，對它們在420 nm處的吸光度值進(jìn)行測定分析。

1.3.8臨床標(biāo)本檢測 參考尿酸臨床檢測范圍，選取6個(gè)工作標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；在最佳反應(yīng)條件下檢測5份臨床血清標(biāo)本，并與臨床日立7600生化分析儀檢測結(jié)果進(jìn)行比較，檢測嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Microsoft Excel2003和 SSPS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同方法檢測的結(jié)果比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1過氧化物模擬酶活性檢測結(jié)果 a管液體在420 nm處有明顯的特征吸收峰，而b管和c管液體在420 nm處幾乎沒有吸收，與肉眼觀察結(jié)果相符，只有當(dāng)ABTS2-、MCA-Pd NPs和H2O2同時(shí)存在時(shí)，才能將無色的ABTS2-變?yōu)榫G色自由基ABTS-，而在420 nm處有特征吸收峰。

2.2MCA-Pd NPs的穩(wěn)定性檢測結(jié)果 到第30天時(shí)吸光度值仍為2.11，與第1天檢測的吸光度值2.185差別微小。

2.3尿酸檢測體系的建立情況 肉眼可見b和c兩管液體由無色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，而a和d兩管液體仍表現(xiàn)為無色，使用紫外-可見分光光度計(jì)在420 nm波長處分別對4管混合液進(jìn)行吸光度值檢測，b和c兩管液體均有較高的吸光度值，而a、c兩管液體在420 nm處幾乎沒有吸收，與肉眼觀察結(jié)果相符，見圖1，MCA-Pd NPs具有與HRP相似的過氧化物酶活性，能應(yīng)用到尿酸檢測體系中。

注：a為蒸餾水+尿酸酶+HRP+ABTS2-；b為尿酸+尿酸酶+ HRP+ABTS2-；c為尿酸+尿酸酶+MCA-Pd NPs+ABTS2-；d為蒸餾水+尿酸酶+MCA-Pd NPs+ABTS2-。圖1 尿酸檢測體系中不同試驗(yàn)管的吸光度值

2.4尿酸檢測體系條件的優(yōu)化情況 (1)MCA-Pd NPs和ABTS2-用量，檢測發(fā)現(xiàn)MCA-Pd NPs和ABTS2-用量分別為80 μL和40 μL時(shí)吸光度值即達(dá)到最高值，后面隨著用量增加，吸光度值沒有增加。在該檢測體系中20 μL 1 mmol/L H2O2要被完全催化還原并表現(xiàn)為溶液顏色的改變，需要MCA-Pd NPs體積>80 μL、ABTS2-體積>40 μL，因此，在后面的檢測體系中將MCA-Pd NPs(0.105 mg/mL)和ABTS2-(90 mmol/L)用量分別固定為100 μL和50 μL。(2)最佳反應(yīng)溫度，在25～37 ℃時(shí)，反應(yīng)體系隨著溫度升高而吸光度值增強(qiáng)，在37～50 ℃時(shí)，吸光度值隨著溫度升高而減弱，MCA-Pd NPs及尿酸酶的酶活性在37 ℃達(dá)到最優(yōu)，選擇37 ℃為體系的最佳反應(yīng)溫度。(3)最佳反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)體系隨著溫育時(shí)間延長而吸光度值增強(qiáng)，在達(dá)到20 min以后，吸光度值隨著時(shí)間的延長而升高不明顯，為了縮短反應(yīng)時(shí)間，使檢測體系更具有實(shí)用性，選擇20 min這個(gè)時(shí)間點(diǎn)為體系的最優(yōu)溫育時(shí)間。見圖2。

圖2 檢測體系在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值變化

2.5臨床血清標(biāo)本檢測結(jié)果 臨床血清標(biāo)本檢測結(jié)果與臨床常用生化分析儀檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，臨床診斷為痛風(fēng)的2例患者(標(biāo)本4和標(biāo)本5)血清尿酸水平均明顯升高，見表1，該檢測體系初步應(yīng)用于檢測臨床血液標(biāo)本是可行的。

表1 兩種檢測方法檢測血清中尿酸的水平(μmol/L)

3 討 論

納米材料具有表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、體積效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)等優(yōu)越性能，在尺寸、形狀和表面電荷等方面與天然過氧化物酶具有一定的相似性，許多納米材料如四氧化三鐵磁性納米粒子(Fe3O4MNPs)、貴金屬納米粒子、碳基納米材料等被發(fā)現(xiàn)具有過氧化物酶活性，并被應(yīng)用到生物傳感、免疫分析、癌癥診斷與治療、神經(jīng)保護(hù)、環(huán)境治理等領(lǐng)域[9-11]。本研究自行設(shè)計(jì)合成的MCA-Pd NPs通過化學(xué)反應(yīng)將鈀納米粒子固定在C3N6H6和C3H3N3O3形成的氫鍵超分子骨架上(MCA)，MCA本身不具備內(nèi)在的過氧化物催化活性，但是由于MCA的氫鍵超分子結(jié)構(gòu)，使它在促進(jìn)納米粒子的催化活性上起到了關(guān)鍵的作用[12-13]，MCA上面的活性位點(diǎn)使微小顆粒的鈀納米粒子吸附穩(wěn)定，并避免了鈀納米粒子的聚集，同時(shí)氫鍵超分子結(jié)構(gòu)為微小顆粒的鈀納米粒子提供了模擬酶骨架，因而具有非常強(qiáng)而穩(wěn)定的類過氧化物酶催化活性，能催化H2O2產(chǎn)生某種中間物質(zhì)，從而進(jìn)一步氧化ABTS2-至ABTS-，使溶液顏色由無色轉(zhuǎn)變成綠色，見圖1，與文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道的具有過氧化物模擬酶活性的納米材料能促進(jìn)過氧化氫分解產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的羥基自由基而氧化底物的說法相一致。

過氧化物酶作為臨床檢驗(yàn)試劑中的常用酶，被廣泛應(yīng)用于各種臨床檢測方法中，但是由于天然過氧化物酶具有性質(zhì)不穩(wěn)定，在生物體的水平較低，提純及儲存較困難，在過酸、過堿及高溫條件下容易失活等缺點(diǎn)，導(dǎo)致天然過氧化物酶的使用條件變得苛刻，因此限制了它的實(shí)際應(yīng)用[17-19]。而納米材料模擬酶能夠模擬天然過氧化物酶的活性，并彌補(bǔ)了天然過氧化物酶的許多不足，具有制備簡單，制造及儲存成本低，容易大規(guī)模生產(chǎn)和保存運(yùn)輸，對外界環(huán)境耐受性強(qiáng)，性質(zhì)比較穩(wěn)定，不易失活等優(yōu)點(diǎn)。而本試驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的MCA-Pd NPs具備制作簡單，易于保存，穩(wěn)定性好，過氧化物酶活性高等與以上所述優(yōu)點(diǎn)相符合的特性。為進(jìn)一步證明MCA-Pd NPs酶活性的實(shí)用性，將其應(yīng)用到基于尿酸酶的比色法尿酸檢測體系中，考慮到檢測體系會受到反應(yīng)物用量、反應(yīng)溫度及溫育時(shí)間等因素的影響，通過設(shè)計(jì)一系列的試驗(yàn)來尋找到該檢測體系的最優(yōu)反應(yīng)條件，并在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行血清標(biāo)本的檢測，檢測結(jié)果與臨床診斷相符合，為下一步擴(kuò)大標(biāo)本量的臨床試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)可靠的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前，臨床上常用于血清尿酸檢測的方法主要是尿酸酶-過氧化物酶耦聯(lián)法[20-22]。本試驗(yàn)將自行設(shè)計(jì)合成的具有類過氧化物酶活性的MCA-Pd NPs取代天然過氧化物酶應(yīng)用到尿酸檢測體系中，對該體系進(jìn)行了改進(jìn)，只需要加入一種底物ABTS2-來替代常規(guī)方法中的3,5-二氯-2-羥苯磺酸(DHBS)和4-氨基安替比林(4-AAP)，就能對血清中的尿酸水平進(jìn)行定量檢測，使檢測體系簡單化，同時(shí)減少影響因素，降低試劑成本，具有實(shí)際意義。此外，臨床中的許多常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，如尿酸、血糖、5′-核苷酶、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等物質(zhì)的檢測原理都涉及過氧化物酶，若能將本課題組自行合成的MCA-Pd NPs應(yīng)用到實(shí)際的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測工作中，具有非常重要而廣泛的實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究通過簡單的一步法合成了性質(zhì)穩(wěn)定、類過氧化物酶活性強(qiáng)的MCA-Pd NPs，一系列的試驗(yàn)研究證明了MCA-Pd NPs具有與HRP相當(dāng)?shù)膹?qiáng)而穩(wěn)定的酶活性，并由此建立一種可初步應(yīng)用于臨床血清標(biāo)本尿酸檢測的比色法。