馮靚 孔梅 張晶

摘要 目的：探討黃連素對多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠卵巢血供的影響。方法：30只大鼠隨機(jī)分為模型組、實驗組和陽性對照組，采用脫氫表雄酮（DHEA）皮下注射構(gòu)建PCOS大鼠;另選10只僅皮下注射大豆油作為對照組，1次/d，連續(xù)注射20 d。實驗組和陽性對照組分別灌胃黃連素（80 mg/kg）和羅格列酮（3 mg/kg），模型組和對照組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)干預(yù)22 d。檢測大鼠血清睪酮（T）和游離睪酮（FT）含量，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠卵巢組織形態(tài)及微血管密度（MVD），原位雜交法與免疫組化法分別檢測大鼠卵巢組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）mRNA水平與甾體類生成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠卵巢組織MVD、VEGF mRNA表達(dá)及StAR蛋白相對表達(dá)量較對照組升高，實驗組和陽性對照組較模型組降低，且實驗組低于陽性對照組（P<0.05）。結(jié)論：黃連素可通過調(diào)控PCOS大鼠卵巢組織血供及血管生成而改善卵巢組織形態(tài)，同時可通過下調(diào)StAR蛋白表達(dá)改善高雄激素血癥。

關(guān)鍵詞 多囊卵巢綜合征;黃連素;卵巢血供;甾體類生成快速調(diào)節(jié)蛋白

Abstract Objective：To investigate the effects of berberine on ovarian blood supply in rats with polycystic ovarian syndrome （PCOS）.Methods：A total of 30 rats were randomly divided into a model group，a test group and a positive control group.Dehydroepiandrosterone （DHEA） subcutaneous injection was used to construct PCOS rats; another 10 rats were selected as the control group by subcutaneous injection of soybean oil，all were intervented once a day for 20 d continuously.The test group and positive control group were given by gavage with berberine 80 mg/kg and rosiglitazone 3 mg/kg respectively.The model group and control group were given 10 mL/kg normal saline by gavage，all were given once a day for consecutive 22 d.The content of testosterone （T） and free testosterone （FT） in serum of rats were detected.Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe rat ovarian tissue morphology and microvessel density （MVD）.In situ hybridization and immunohistochemistry were used to detect vascular endothelial growth factor （VEGF） mRNA levels，producing rapid regulatory protein （StAR） protein expression with steroids.Results：The expression of MVD and VEGF mRNA and the relative expression of StAR protein in the ovarian tissue of the model group were higher than those of the control group，and the test group and the positive control group were lower than the model group.The experimental group was lower than the positive control group （P<0.05）.Conclusion：Berberine can improve ovarian morphology by regulating blood supply and angiogenesis in ovarian tissues of PCOS rats; and can improves hyperandrogenism by down-regulating the expression of StAR protein.

Keywords Polycystic ovary syndrome; Berberine; Ovarian blood supply; Producing rapid regulatory protein （StAR） protein expression with steroids

中圖分類號：R285;R271.14 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.010

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）是常見的婦科生殖障礙性疾病，育齡婦女多發(fā)，以持續(xù)性無排卵、胰島素抵抗（IR）及高雄激素為主要特征，也是造成女性不孕的主要誘因之一。黃連素又被稱為小檗堿，是從多種中藥中提取的異喹啉類生物堿，具有降糖降脂作用[1]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其還具有抑制雄激素合成的作用，而甾體類生成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）是決定雄激素產(chǎn)生量和速度的關(guān)鍵蛋白。本研究探討黃連素對PCOS大鼠卵巢血供及StAR蛋白表達(dá)的干預(yù)效果[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量160～220 g，購自山東綠葉制藥有限公司，生產(chǎn)合格證號：SCXK（魯）20130009。飼養(yǎng)條件：山東綠葉制藥有限公司屏障環(huán)境動物實驗室，光照明暗時間比為12 h/12 h，濕度（55±2）%，溫度（25±2）℃，自由獲取食物和水。

1.1.2 藥物 黃連素（成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號：121014）;脫氫表雄酮（DHEA）（湖北芳通藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：15032516）;羅格列酮片（天方藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：15120958）。

1.1.3 試劑與儀器 血睪酮（T）和游離睪酮（FT）測定試劑盒（DRG，德國，型號：EIA-2924）;血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）原位雜交試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，型號：MK1142）;StAR免疫組化試劑盒（Santa Cruz公司，美國，型號：RS-3570R）;DVM5000 HD型高分辨顯微鏡（Leica公司，德國，型號：DVM5000 HD）;HM525冷凍切片機(jī)（MICROM公司，德國，型號：HM525）;BDNM-9602G自動酶標(biāo)儀（Biotek公司，美國，型號：BDNM-9602G）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 40只大鼠隨機(jī)分為對照組（n=10）、模型組（n=10）、陽性對照組（n=10）、實驗組（n=10），通過皮下注射DHEA（60 mg/kg）、大豆油（0.2 mL·只）構(gòu)建PCOS大鼠模型，對照組僅皮下注射大豆油，均1次/d，連續(xù)注射20 d，模型構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)：陰道上皮細(xì)胞連續(xù)2個性周期出現(xiàn)細(xì)胞角化現(xiàn)象，并失去動情周期[3]。

1.2.2 給藥方法 實驗組和陽性對照組分別灌胃黃連素（80 mg/kg）和羅格列酮（3 mg/kg），模型組和對照組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)干預(yù)22 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測PCOS大鼠血清T和FT含量 干預(yù)結(jié)束后采集各組大鼠尾靜脈血液2 mL，8 000 r/min離心5 min，離心半徑16 cm，采用ELISA法檢測大鼠血清T和FT含量。

1.2.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色法[4]觀察PCOS大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 采血后斷頭處死大鼠，取大鼠卵巢組織，經(jīng)固定后常規(guī)制作石蠟切片，并行HE染色，觀察大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化;并選取5個微血管密集區(qū)，觀察微血管數(shù)目，取其均值表示微血管密度（MVD）。

1.2.3.3 原位雜交法[5]檢測PCOS大鼠卵巢組織中VEGFmRNA水平 取各組大鼠卵巢組織制備冰凍切片，4%多聚甲醛室溫固定0.5～1.0 h，暴露mRNA核酸片段，胃蛋白酶消化，每張切片加20 μL預(yù)雜交液，預(yù)雜交3 h后加20 μL VEGF寡核苷酸探針雜交液，雜交過夜，洗滌、封閉處理后，顯色，封片。高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、分布，細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色為VEGF mRNA陽性表達(dá)，采用BST-20-M全自動圖像分析系統(tǒng)分析。

1.2.3.4 免疫組化[6]檢測PCOS大鼠卵巢組織StAR蛋白表達(dá)情況 取卵巢組織石蠟切片，經(jīng)預(yù)處理后，加StAR一抗，按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性著色，光學(xué)顯微鏡下判定染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，2組間比較進(jìn)行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清T和FT含量比較 與對照組比較，模型組大鼠血清T和FT含量升高（P<0.05），與模型組比較，實驗組和陽性對照組大鼠血清T和FT含量降低（P<0.05），且實驗組血清T含量低于陽性對照組（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化及卵巢血供 ? 對照組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠卵泡呈多囊性擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層減少，且黃體數(shù)目較少;實驗組和陽性對照組大鼠黃體數(shù)目增多，可見各個發(fā)育階段的卵泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)目較模型組增多。見圖1。與對照組比較，模型組大鼠卵巢組織MVD升高，VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），而實驗組和陽性對照組卵巢組織MVD較模型組降低，VEGF mRNA表達(dá)減弱，其中實驗組卵巢組織MVD較陽性對照組降低，VEGF mRNA表達(dá)減弱（P<0.05）。見表2。

2.3 大鼠卵巢組織StAR蛋白表達(dá) 對照組、模型組、實驗組和陽性對照組StAR蛋白相對表達(dá)量（個·mm2）為（1.43±0.21）、（6.54±0.36）、（2.42±0.56）、（3.28±0.39），模型組StAR蛋白相對表達(dá)量較對照組升高，實驗組和陽性對照組較模型組降低（P<0.05），且實驗組低于陽性對照組（P<0.05）。見圖2。

3 討論

卵巢生長、黃體形成均依賴于毛細(xì)血管增生，血管生成也是正常周期性卵巢的重要功能，同時黃體細(xì)胞對膽固醇合成孕酮發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究認(rèn)為，PCOS無排卵或排卵障礙的重要原因為間質(zhì)及囊泡血管生成增多[7]。VEGF可通過促進(jìn)毛細(xì)血管生成等而參與卵泡發(fā)育、成熟及排卵過程，VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄增加可提高微血管通透性，引起排卵過程中卵泡壁破裂，最終導(dǎo)致PCOS的發(fā)生;且報道顯示，PCOS大鼠卵巢組織及血清中VEGF mRNA表達(dá)均較正常大鼠明顯升高[8]。本研究中同樣顯示出，模型組大鼠卵巢組織MVD升高，VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而經(jīng)藥物干預(yù)后實驗組和陽性對照組卵巢組織MVD降低，VEGF mRNA表達(dá)減弱。表明黃連素干預(yù)能有效調(diào)控PCOS大鼠卵巢組織血供及血管生成進(jìn)而改善卵巢組織形態(tài)。

卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生IR后雄激素合成能力顯著增強(qiáng)，黃連素能降低卵泡膜細(xì)胞的雄激素合成;黃連素還能降低地塞米松誘導(dǎo)的卵泡膜細(xì)胞模型的IR程度和雄激素合成水平，對PCOS有良好的治療作用[9-10]。本研究中模型組大鼠血清T和FT含量較對照組升高，實驗組大鼠血清中T和FT含量較模型組降低，表明PCOS模型大鼠處于高雄激素血癥狀態(tài)，而經(jīng)黃連素干預(yù)后大鼠雄性激素水平普遍降低，表明黃連素可降低PCOS模型大鼠較高的雄激素水平。免疫組化染色可看到PCOS大鼠卵泡膜細(xì)胞膜上StAR表達(dá)活躍，其可加速膽固醇合成雄激素的進(jìn)程，從而導(dǎo)致高雄激素血癥，而經(jīng)藥物干預(yù)后，實驗組和陽性對照組StAR表達(dá)量明顯降低，有研究報道，黃連素也具有一定的降脂作用，因此黃連素是否能通過其他途徑降低雄激素水平尚需進(jìn)一步研究[9]。

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（2020-08-14收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）