閆春陽，王碧琳，莊德舒，張 祎，魏子征，畢良佳

菌斑細(xì)菌生物膜作為公認(rèn)的口腔慢性感染性疾病的始動因子，導(dǎo)致慢性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展。由于口腔是對外開放環(huán)境，更易被不同細(xì)菌附著[1]。細(xì)菌一旦形成有膜的結(jié)構(gòu)，將具備遠(yuǎn)大于浮游、單個、散在致病菌的10～1 000倍強耐藥性、強侵襲力、群體感應(yīng)性及較低的抗生素敏感性，成為口腔細(xì)菌感染的始動因素。當(dāng)微環(huán)境因子(micro-environmental factors)、β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)在特定部位達(dá)到較高濃度時對抗菌劑產(chǎn)生影響?？谇簧锬さ娜航Y(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，由表面到深層質(zhì)地增密，氧氣含量卻逐漸降低，存在不易被唾液緩沖和稀釋的弱酸成分。針對口腔內(nèi)的致病菌，簡單的刷牙雖有一定效果但不能完全去除[2]，抗菌治療是當(dāng)前被廣泛應(yīng)用的治療手段?？股氐闹委煼椒ǚ譃榫植恐委熂叭碇委?，但二者都存在局限性。常表現(xiàn)為：不能完全抵達(dá)炎癥部位，不能有效破壞牙菌斑中的主要致病菌構(gòu)成的生物膜結(jié)構(gòu)，存在化學(xué)毒性、耐藥性及二重感染性，因此治療效果不佳。例如，廣譜抗生素雖可有效殺滅口腔致病菌，但同樣也會引起口腔內(nèi)細(xì)菌的菌群失調(diào)并伴隨口腔潰瘍、糜爛等問題。且與單個浮游的細(xì)菌相比，菌斑生物膜的耐藥性能更強，難以做到完全被清除。機械療法在口腔臨床操作中常分為潔治和刮治，對醫(yī)生的臨床操作水平要求較高且對周圍無炎癥的健康牙周組織損傷較大。研究表明菌斑生物膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、細(xì)菌組成和可變的表面形態(tài)是其耐藥性的根源[3-5]，其特定的酸堿度微生態(tài)環(huán)境[6]影響著菌斑生物膜中物質(zhì)的運輸。

超聲(ultrasound, US)是一種靶向定位性強、穿透能力優(yōu)良的機械波，可聯(lián)合抗菌藥物或聲敏劑(以卟啉及卟啉類衍生物為主，產(chǎn)生單線態(tài)氧、活性氧、過氧化氫等物質(zhì))，在殺菌方面效果突出。聲動力療法(sonodynamic therapy, SDT)是由聲敏劑血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether, HMME)介導(dǎo)的一種治療方法，日本科學(xué)家Umemura等[7-8]首次提出，基于光動力療法(photodynamic therapy, PDT)作用原理，在外界刺激下產(chǎn)生高氧化性能的物質(zhì)。SDT中的US在組織內(nèi)定位精確、穿過組織時不易擴散、穿透的深度強于PDT，其非侵入性、更小不良反應(yīng)性、不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性及靶向治療的特點具有優(yōu)良的潛力。已有研究表明，由US激活HMME產(chǎn)生的單線態(tài)氧、過氧化氫等活性氧物質(zhì)在治療實體腫瘤細(xì)胞中有明顯效果。本實驗旨在研究SDT對菌斑細(xì)菌生物膜活性及膜性結(jié)構(gòu)的影響，為臨床慢性牙周炎治療提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牙周炎患者牙菌斑；哥倫比亞血平皿(含50 ml/L脫纖羊血、5 mg/L氯化血紅素、1 mg/L維生素K1，海博生物，中國)；HMME(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司，中國)；CM1135B腦心浸液培養(yǎng)基(500 g/瓶、Oxoid，英國)；厭氧袋(三菱公司，日本)；厭氧產(chǎn)氣袋(三菱公司，日本)；厭氧指數(shù)劑(三菱公司，日本)；LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit試劑盒(L7007，Thermo Fisher Science，中國)；二甲基亞砜(DMSO，江蘇永健化工有限公司，中國)；24孔配套細(xì)胞爬片(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，中國)；96、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(北京澤平科技有限責(zé)任公司，中國)；35 mm平皿(北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，中國)；無菌Gracy牙周刮治器(Hu-Friedy,美國)；量程為0～20 μL、0～1 000 μL移液槍(力辰科技有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 儀器 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱(Heraeus公司，德國)；脈沖超聲波儀器(哈爾濱工業(yè)大學(xué)物理凝聚態(tài)實驗室，中國)；可見光分光光度計UV762型(東莞市譜標(biāo)實驗器材科技有限公司，中國)；超凈工作臺DL-CJ-1NDⅡ型(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，中國)；立式高壓滅菌器YXQ-LS-75G型(上海博訊實業(yè)有限公司，中國)；高壓滅菌器SX500型(上海萊睿科學(xué)儀器有限公司，中國)；水浴震蕩器HZS-H型(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司，中國)。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 用無菌牙周刮治器刮取牙周炎患者的齦下菌斑放置BHI液體37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)，牙菌斑細(xì)菌懸液使用分光光度法監(jiān)測培養(yǎng)，用分光光度計OD600=1.00確定濃度。當(dāng)OD600=1.00時，樣本細(xì)菌含量約為1×107個/mL，并加入已配比好的營養(yǎng)成分于無菌EP管中液體培養(yǎng)備用。

1.2.3 HMME制備 HMME由無菌PBS稀釋到10、20、30、40、50、60 mg/L，在-20 ℃的冰箱中避光保存?zhèn)溆?。使用時經(jīng)水浴箱避光加熱至37 ℃即可。

1.2.3 取樣標(biāo)準(zhǔn) 取2018年12月至2019年6月于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科就診的牙周炎患者6例(患者均簽署知情同意書，本研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn))。用無菌Gracy牙周刮治器刮取上頜頰側(cè)或下頜舌側(cè)齦下菌斑，囑患者提前24 h不刷牙，且不使用漱口水等破壞口腔齦下菌斑的藥物。將臨床上收集到的齦下菌斑置于裝有0.9%的生理鹽水、密封性能良好的無菌EP管中，37 ℃恒溫箱、厭氧保存。于離心機(5 000g、10 min)去除上清液，置于裝有BHI液體培養(yǎng)基的EP管中37 ℃、厭氧培養(yǎng)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡18～70歲；無全身系統(tǒng)性疾病如糖尿病等；無飲酒、吸煙等不良嗜好；近6個月內(nèi)未曾接受過牙周、牙體牙髓治療；30 d內(nèi)無抗生素用藥史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患有全身性疾病的患者；孕婦和哺乳期婦女；在檢查之前接受過牙周治療；在研究前30 d內(nèi)使用過抗生素；口腔急性不可控性損害；牙髓疾病；參與本實驗的研究人員。

1.2.4 HMME對齦下菌斑細(xì)菌生物膜的最小抑菌濃度 確定HMME在US強度為3 W/cm2、5 min的最小抑菌濃度。吸取均勻含有1.0 mL的牙菌斑細(xì)菌懸液置于無菌35 mm平皿上進行厭氧、37 ℃、孵育24 h，形成膜結(jié)構(gòu)(經(jīng)顯微鏡觀察確定)，用移液槍將懸浮液吸去。分別加入濃度為10、20、30、40、50、60 mg/L的HMME進行避光(0 mg/L HMME組為Control組用0.9%生理鹽水替代)、厭氧、37 ℃孵育90 min，移液槍吸取平皿中懸浮菌液，置于EP管中，為后續(xù)菌落形成單位(colony-forming units,CFU)計算細(xì)菌生存率做準(zhǔn)備。樣本6例，每組重復(fù)3次，用計數(shù)軟件Image J進行分析。

1.2.5 SDT分組 吸取200 μL的OD600=1.00的牙菌斑細(xì)菌懸液置于無菌的96孔板中，厭氧、37 ℃孵育24 h后形成帶膜結(jié)構(gòu)(經(jīng)顯微鏡觀察確定)，用移液槍輕柔吸去懸浮液。隨機分4組，1組為Control組，0.9%生理鹽水200 μL；2組為單純HMME組，HMME溶液(50 mg/L，最小抑菌濃度)200 μL；3組為單純US組(3 W/cm2、5 min)，0.9%生理鹽水200 μL；4組為SDT組為US(3 W/cm2、5 min)和HMME溶液(最小抑菌濃度)200 μL均避光孵育90 min。樣本6例，每組重復(fù)3次，Image J分析得到細(xì)菌存活率。

1.2.6 CFU 將處理好的牙菌斑細(xì)菌懸液用量程為20 μL的移液槍吸取20 μL溶液均勻分布在BHI血平板上37 ℃、厭氧培養(yǎng)7 d，在同一地點、相同光線下對BHI血平板進行拍照，并用Image J進行計數(shù)，將數(shù)據(jù)用來確定HMME最小抑菌濃度和SDT條件下細(xì)菌的生存率。

1.2.7 激光共聚焦掃描電鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察菌斑細(xì)菌生物膜中細(xì)菌死/活菌分布 檢測菌斑細(xì)菌生物膜的生存結(jié)構(gòu)，利用光學(xué)原理不僅可以2D也可以3D重建[9]，并觀察檢測細(xì)菌生物的動態(tài)變化過程[10]。對SDT組使用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit試劑盒，將1.0 mL牙菌斑細(xì)菌懸液在35 mm平皿中37 ℃、厭氧、孵育4 d，成膜(顯微鏡觀察確定)。用移液槍輕柔吸取懸浮液后，用3 μL的SYTO 9和PI混合物分別加入提前處理好成膜的35 mm平皿中，避光、37 ℃、孵育15 min，與LIVE/DEADTMBaclightTMBacterial Viability試劑盒混合。用FITC-TRITC雙帶激發(fā)濾波器對SYTO 9和PI進行細(xì)菌染色效果進行觀察。激光強度在SYTO 9激發(fā)光約為476/500 nm(綠色)通過發(fā)射濾光片觀察活細(xì)胞和PI激發(fā)光約為476/635 nm(紅色)通過發(fā)射濾光片觀察死細(xì)胞。

1.2.8 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察菌斑細(xì)菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 SDT 4組中選取無菌24孔板、細(xì)胞爬片(與24孔板配套、直徑12 mm)，加入300 μL牙菌斑細(xì)菌懸液37 ℃、厭氧、孵育4 d，鏡下檢查細(xì)胞爬片成膜。①取材：將覆有細(xì)胞的細(xì)胞爬片取出；②固定：用無菌pH=6.8的PBS溶液輕柔地沖洗3次，除去漂浮菌，2.5%戊二醛(pH=7.2)、4 ℃冰箱中固定1.5 h以上；③沖洗：分別用0.1 mL PBS溶液沖洗2～3次，每次10 min；④脫水：依次取30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進行脫水，每次10～15 min，100%的乙醇脫水2～3次，每次10～15 min；⑤置換：100%乙醇∶叔丁醇=1∶1，純叔丁醇各1次，每次15 min；⑥干燥：-20 ℃冷凍、30 min、干燥4 h；⑦粘樣：被檢測面向上，導(dǎo)電膠帶粘在掃描電鏡樣品臺上；⑧鍍膜：離子濺射鍍膜儀鍍金屬；⑨膜檢測：樣品于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

相應(yīng)實驗數(shù)據(jù)用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件處理，應(yīng)用單因素方差分析的統(tǒng)計學(xué)方法，采用LSD-t檢驗比較不同組別之間的差異。當(dāng)P<0.05時，存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 HMME對菌斑細(xì)菌生物膜的最小抑菌濃度

如表1所示，50 mg/L的HMME組的牙菌斑CFU相對于0、10、20、30、40 mg/L HMME組的牙菌斑的CFU明顯降低，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系明確(P<0.05)。但相比于60 mg/L HMME組，牙菌斑的CFU明顯增加(P<0.05)。因此HMME對牙菌斑的最小抑菌濃度為50 mg/L。

表1 HMME對齦下菌斑細(xì)菌生物膜的最小抑菌濃度Tab.1 Minimum inhibitory concentration of HMME on bacterial biofilm of subgingival plaque

2.2 SDT對菌斑細(xì)菌生物膜的CFU的影響

如圖1所示，其中，HMME組CFU與Control組有顯著性差異(P<0.05)；US組與Control組、HMME組有顯著性差異(P<0.05)；SDT與Control組、HMME組有顯著性差異(P<0.05)；US組與SDT組差異性不明顯。HMME組、Control組牙菌斑CFU均為正態(tài)分布關(guān)系。且SDT組細(xì)菌存活率僅為0.15%、US組細(xì)菌存活率為7.94%、HMME組細(xì)菌存活率為61.83%。

HMME組與Control組比，P<0.05；US組與HMME、Control組比，P<0.05；SDT組與HMME、Control組比，P<0.05圖1 SDT對菌斑細(xì)菌生物膜的殺傷效果Fig.1 The killing effect of SDT on dental plaque bacterial biofilm

2.3 SDT對菌斑細(xì)菌生物膜的死/活菌檢測

如圖2所示，SDT組、US組、50 mg/L HMME組菌斑細(xì)菌生物膜的活菌的分布明顯低于Control組(P<0.05)。SDT組、US組菌斑細(xì)菌生物膜的活菌明顯低于50 mg/L HMME組，死菌分布高(P<0.05)。SDT組與US組相比活菌更少，以死菌作為主體存在(P<0.05)。

圖2 CLSM觀察SDT對牙菌斑細(xì)菌生物作用的影響Fig.2 Confocal laser scanning microscope to observe the effect of SDT on the biological effects of dental plaque bacteria

2.4 SDT對菌斑細(xì)菌生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響

如圖3所示，Control組的生物膜結(jié)構(gòu)趨于完整、致密，細(xì)菌與細(xì)菌間粘附集聚呈團狀、細(xì)菌形態(tài)完整、邊緣清晰、膜結(jié)構(gòu)及細(xì)菌排列密度高。HMME組相比較于Control組差異不明顯；SDT組相比于其他3組，變化最為明顯，表現(xiàn)為菌斑細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)完整性被破壞伴隨疏松狀態(tài)、細(xì)菌形態(tài)改變、邊緣模糊、膜結(jié)構(gòu)及細(xì)菌排列密度低。

圖3 SEM觀察SDT對菌斑細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Scanning electron microscopy images to observe of the effect of SDT on the plaque bacterial biofilm structure

3 討 論

中老年人牙齒缺失的首要因素是慢性牙周炎[11]，菌斑生物膜作為一種不易被水沖去[12]的膜結(jié)構(gòu)，臨床中易導(dǎo)致牙周炎。菌斑生物膜是由以厭氧菌作為主體構(gòu)成的膜性結(jié)構(gòu)。細(xì)菌膜性結(jié)構(gòu)的耐藥性相比較浮游、單個、散在細(xì)菌強10～1 000倍，破壞細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)成為目前治療牙周炎的難點。臨床上常見傳統(tǒng)方法為：機械療法包括潔治與刮治但對菌斑生物膜的清除能力不足；抗生素療法則存在耐藥性、二重感染性及不能緩釋藥物維持藥物濃度的缺點。SDT的促滲作用可協(xié)同藥物作用，增強藥物療效，但目前沒有足夠?qū)嶒炞C實SDT對菌斑細(xì)菌生物膜有破壞作用，本課題組通過SDT對菌斑生物膜的細(xì)菌活性及膜結(jié)構(gòu)進行檢測，完善SDT的相關(guān)性能，同時也為進一步探索牙周炎治療手段提供良好思路。

聲敏劑是一類聲敏性化合物，在靶組織中被US激活，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。聲敏劑存在眾多衍生物，常見為卟啉類化合物、抗癌藥、非甾體類抗炎藥、黃原酮類化合物及其他聲致敏劑[13]。卟啉類化合物作為主流聲敏劑應(yīng)用廣泛，Umemura等[14]實驗表明，50 mg/L的血卟啉對S-180細(xì)胞無細(xì)胞毒性，但當(dāng)增加US強度和照射時間(3.2 W/cm2、 1 min)，細(xì)胞致死率可高達(dá)98%。

US作為外源性刺激常產(chǎn)生空化、熱、機械、輻射壓力及聲流微效應(yīng)。目前超聲空化效應(yīng)[15]最被大家認(rèn)可，空化效應(yīng)是加入額外的周期性變化的US使存在于液體內(nèi)的微泡被拉開成空化核的一種閾效應(yīng)[16]，可增強靶向藥物的濃度、保證半衰期、達(dá)到緩釋的效果時增強滲透作用。US的頻率和強度增加與細(xì)菌的存活率呈負(fù)相關(guān)性[17-18]。US的發(fā)展史已有近百年，1929年Harvey等[19]首次發(fā)現(xiàn)US在殺菌方面有效果，1991年Scherba等[20]證實US對大腸桿菌等常見致病易感菌群殺傷效果顯著，超聲空化效應(yīng)被認(rèn)為是主要效應(yīng)機制。1997年Qian等[21]發(fā)現(xiàn)慶大霉素介導(dǎo)的US對銅綠假單胞菌有殺傷效果，表明US與抗生素在殺菌方面有著協(xié)同作用。Zhuang等[22]體外細(xì)菌實驗表明，HMME介導(dǎo)的SDT對金黃色葡萄球菌有顯著的殺菌效果。隨后，蔣治楠等[23]2016年發(fā)現(xiàn)US可以增加HMME在金黃色葡萄球菌生物膜的滲透程度，滲透程度與強度、頻率和作用時間相關(guān)。2018年許亞玲等[24]使用低頻超聲US作用在表皮葡萄球菌生物膜后，生物膜結(jié)構(gòu)排列不再緊密且表皮葡萄球菌數(shù)量下降。

慢性牙周炎致病菌主要為兼性厭氧菌和/或厭氧菌，US同樣對厭氧菌存在治療效果。2019年王瑋等[25]研究發(fā)現(xiàn)在人離體牙的根管中加入糞腸球菌(兼性厭氧菌)，經(jīng)孵育14 d后形成生物膜結(jié)構(gòu)，當(dāng)US聯(lián)合2.5%的NaClO溶液作用時，經(jīng)掃描電鏡顯示可有效地破壞并去除人離體牙根管壁上的成熟糞腸球菌生物膜結(jié)構(gòu)。2019年孫菲等[26]通過觀察健康種植體、種植體周圍炎內(nèi)齦溝液中牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌含量，證實種植體周圍炎組內(nèi)齦溝液中牙齦卟啉單胞菌檢出含量明顯高于健康種植體組；而血鏈球菌的檢出率卻明顯低于健康種植體組。2019年尚新華等[27]利用US聯(lián)合甘氨酸行齦下噴砂術(shù)可去除種植體表面牙石和附著的菌斑生物膜，使種植體表面恢復(fù)光滑平整、細(xì)菌生物膜的附著降低。當(dāng)使用甘氨酸顆粒(直徑為65 μm)對實驗組內(nèi)牙6個定位點進行噴砂5 s、0.9%生理鹽水沖洗20 s，發(fā)現(xiàn)牙齦紅腫出血、探診深度均有所改善。以上實驗都可以證實US對厭氧菌的殺傷效果顯著，并為SDT治療厭氧菌組成的膜結(jié)構(gòu)提供有利基礎(chǔ)。

綜上所述，SDT(強度3 W/cm2、5 min、50 mg/L HMME)對菌斑細(xì)菌生物膜有顯著的殺傷效果，這為慢性牙周炎的治療提供有利依據(jù)，為早日臨床治療提供可能性。本課題組將利用SDT穿透能力強及定位準(zhǔn)確這一優(yōu)勢特性，進一步完善性能滿足臨床上精準(zhǔn)治療的需求，使其作為新一代潛能良好的治療方法，早日應(yīng)用于臨床治療。