武 潔，劉 茜，陳央蘭，周紅艷，梅予鋒

我國兒童乳牙齲齒患病率居高不下，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題，可導致患兒疼痛、咀嚼進食能力下降、睡眠障礙、注意力不集中、生活質量下降等問題。嚴重齲齒可能導致兒童體質量減輕，生長遲緩，影響兒童的成長和發(fā)育[1]。

窩溝封閉劑已被證明是預防窩溝齲的有效方法[2]，封閉劑的物理屏障作用，可以防止口腔細菌和飲食碳水化合物在牙齒的窩溝點隙內聚集，形成酸性環(huán)境，導致牙齒結構的破壞。由于樹脂封閉劑操作過程需要完全隔濕，但是兒童口腔隔濕困難，尤其是欠合作兒童，因此玻璃離子封閉劑可以為兒童提供更好的替代辦法[3]，其緩慢釋放氟離子的特性有助于發(fā)揮對窩溝和光滑面防齲作用，并且可以促進早期齲的再礦化[4-5]。有文獻報道酸蝕可提高玻璃離子與牙釉質微拉伸強度[6]，本實驗通過對酸蝕與配套液體為處理劑兩種不同釉質處理方法，觀察乳牙玻璃離子窩溝封閉微滲漏和微拉伸強度的影響，為臨床開展兒童窩溝封閉防齲提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與主要實驗儀器

1.1.1 窩溝封閉材料 Ketac?Molar Easymix 玻璃離子粉套裝(3M ESPE公司，美國)；35% 釉質酸蝕劑(GLUMA公司，德國)；1% 亞甲藍溶液(雷根生物，中國)。

1.1.2 實驗儀器 體視顯微鏡(Nicon，SM10000，日本)；微拉伸測試儀(BISCO，MECMESIN,英國)；冷熱循壞儀(威爾，Tc-501F，中國)；醫(yī)用硬組織切片機(BUEHLER，ISOMET，德國)；電子顯微鏡(東芝，SU3500，日本)。

1.1.3 樣本選擇 收集臨床拔除滯留，無齲、窩溝點隙深[7]、冠部完整的第二乳磨牙共24顆，其中微滲漏、微拉伸實驗各10顆，電鏡實驗4顆。清洗后置入4 ℃生理鹽水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 窩溝封閉 10顆離體保存的第二乳磨牙，酸蝕組和處理劑組每組各5顆。兩組均遵循ART窩溝封閉程序操作[7]。①牙面處理，先用小毛刷低速清理窩溝表面10 s，三用槍吹干，酸蝕組采用35%磷酸酸蝕劑處理牙面窩溝40 s，然后三用槍沖洗10 s去除酸蝕劑，吹干。處理劑組僅用小棉球蘸Ketac?Molar Easymix 玻璃離子配套液體涂擦窩溝表面約15 s，然后用濕棉球擦干，避免過度干燥。②放置窩溝封閉劑，在戴手套的食指上涂上少量的凡士林，采用“指壓法”用食指將攪拌好的封閉劑壓入窩溝中，輕輕加力10～15 s后將手指側移。③待凝固后去除多余封閉劑。

1.2.2 微滲漏樣本制備 兩組樣本冷熱循環(huán)(4 ℃，37 ℃) 500次[8]，每個溫度停留30 s。之后將標本取出吹干，每組5個標本進行微滲漏實驗，采取浸蠟法封閉根尖孔及根方側支根管，并在距封閉劑邊緣1 mm外的牙冠均勻涂布兩層指甲油，晾干后把樣本在37 ℃ 1%亞甲藍溶液中浸泡24 h，蒸餾水徹底沖洗標本殘留的染料，截根，固定醫(yī)用硬組織切割機上，沿中央溝及近、遠中點隙3點連線相應的位置片切標本，每個標本得到2個剖面，共計20個剖面。

1.2.3 微滲漏測定 采用單盲法，由兩位進行過標準一致性檢驗的檢查者在體視顯微鏡( ×30)下，對每個切片進行檢測，并采用0～4五級計分[9](圖1)。微滲漏指數計分：0=無染色滲透；1=近中或遠中的一側窩溝壁染色滲透；2=近中和遠中側窩溝壁均染色滲透；3=近中和遠中側窩溝壁封閉劑下方染色滲透；4=整個封閉劑周圍均染色滲透。每個切片經過2位評估者共2次評分，以2個評分中的最高分記錄。

A：微滲漏計分1；B:微滲漏計分2；C:微滲漏計分3；D:微滲漏計分4圖1 微滲漏計分Fig.1 The grade scale of micro-leakage score

1.2.4 微拉伸實驗 將10顆離體牙平牙頸部截取牙冠,取平坦的頰面釉質約5 mm×5 mm，800 目碳化硅砂紙打磨40 s，將內徑3 mm、高5 mm的圓柱形模具垂直置于制備好的牙面上,用蠟封閉模具邊緣。離體牙隨機分成2組，每組5顆。酸蝕組：35%磷酸酸蝕40 s，沖洗20 s,徹底干燥；處理劑組：采用配套的液體涂擦牙面，氣槍輕吹10 s。兩組樣本表面處理后，均填入調拌好Ketac?Molar Easymix玻璃離子，指壓固化后取下模具，每個受試釉質面上形成一個窩溝封閉劑小柱。樣本再經硬組織切割機切成1 mm×1 mm×10 mm試件,封閉劑小柱與牙齒各5 mm長。每個樣本得到2個完整試件。

1.2.5 微拉伸測定 用游標卡尺測量每個試件粘結面的實際面積，再將試件用ZAPIT膠固定于微拉伸儀上檢測其拉伸粘結強度，加載速度為0.5 mm/min，直至窩溝封閉劑與牙面斷裂,記錄每個試件的微拉伸粘結強度。每顆牙齒的拉伸粘結強度取其兩個小試件的平均值。計算公式：微拉伸粘結強度(N/mm2)=斷裂時最大載荷/粘結面積。

1.2.6 掃描電鏡觀察 選取4顆離體第二乳磨牙，隨機分酸蝕和處理劑處理兩組。每組各取1顆并按以上方法進行窩溝封閉后標本，用慢速金剛砂片截除牙根，并用硬組織切割機，沿近、遠中窩溝片切樣本，水磨砂紙拋光，沖洗，干燥，固定于樣品臺上，噴金鍍膜，用掃描電鏡觀察窩溝封閉劑與牙面結合情況，采用Image-Pro Plus 6.0圖形處理軟件，對1 000、2 000倍電鏡照片測量封閉材料與釉質之間的微間隙(μm)，取兩側窩溝壁，每側從小到大取5個測量點，每組10個測量點。余下每組各1個樣本不做窩溝封閉，僅用掃描電鏡觀察牙合面窩溝表面釉質經不同方法處理后的結構變化。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數據采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對資料作整理與分析，微滲漏兩組間的測試數據比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗，微拉伸兩組間的測試數據比較采用t檢驗，所有檢驗水平均設為ɑ=0.05 。

2 結 果

2.1 微滲漏情況比較

兩位觀察者對各組微滲漏評分經Kappa一致性檢驗，Kappa值為0.79，顯示兩者一致性優(yōu)。酸蝕組微滲漏評分低于處理劑組，經Mann-WhitneyU秩和檢驗兩組間有顯著性差異，Z=2.50，P=0.012，見表1。

表1 酸蝕與處理劑兩組乳磨牙微滲漏計分比較Tab.1 Distribution of micro-leakage between two groups with acid etching and liquid in primary molars

2.2 微拉伸情況比較

酸蝕組微拉伸結合強度高于處理劑組，有顯著性差異(P<0.05)，見表2。

表2 酸蝕與處理劑兩組乳磨牙微拉伸強度比較Tab.2 Comparison of microtensile bond strength between two groups with acid etching and liquid in primary molars

2.3 掃描電鏡觀察

2.3.1 酸蝕與處理劑兩組乳磨牙電鏡照片 乳磨牙牙合面、剖面釉質酸蝕和液體處理后的電鏡照片見圖2～3。

2.3.2 電鏡照片圖形軟件測量 結果顯示酸蝕組微間隙寬度為(0.90±0.25)μm，處理劑組為(1.90 ± 0.65)μm，經統(tǒng)計學處理t=4.97，P<0.01，有顯著性差異(圖4)。

A：酸蝕組為柱間質脫礦，釉質呈典型蝕刻結構；B：處理劑組為釉質表面粗超呈細小的蜂窩微孔結構圖2 乳磨牙牙合面釉質酸蝕和液體處理后電鏡照片比較( ×1 000)Fig.2 SEM images of occlusions of primary second molars with acid-etched and liquid-conditioned enamel( ×1 000)

A：酸蝕組乳磨牙剖面顯示玻璃離子封閉材料與窩溝壁結合部位有細小斷續(xù)的縫隙( ×50)；B: 處理劑組乳磨牙剖面顯示玻璃離子封閉材料與窩溝壁結合部位細小斷續(xù)的縫隙( ×50)；C: 酸蝕處理后玻璃離子封閉材料與窩溝壁結合部位斷續(xù)的嵌合層、窄的縫隙( ×2 000)；D：處理劑組處理后乳磨牙剖面顯示玻璃離子封閉材料與窩溝壁結合部位少量嵌合點、寬而長的縫隙( ×2 000)圖3 乳磨牙剖面釉質酸蝕和液體處理后電鏡照片Fig.3 Cross-section SEM images at interfaces of the enamel-GIC sealants

圖4 兩組封閉材料與窩溝微間隙比較Fig.4 Micro-fractures were measured at interfaces of the enamel-GIC sealants

3 討 論

窩溝點隙部位患齲風險是光滑面的8倍[10]，學齡兒童約50%的齲齒位于咬合面[11]。Gawali等[12]報道兒童第二乳磨牙最容易發(fā)生窩溝齲齒。江蘇省3～5歲兒童齲病流行病學抽樣調查報告[13]顯示：乳牙患齲水平居高不下，且呈現上升趨勢，5歲兒童患齲率和齲均分別為71.43%和4.05。幼兒患齲情況不容樂觀，應重點針對這一高危人群進行防治[14]。因此，開展窩溝齲的預防具有十分重要的意義。

美國牙醫(yī)學會(ADA)發(fā)布的以循證為基礎的窩溝封閉指南指出窩溝封閉在預防和阻止兒童和青少年乳、恒磨牙的牙合面齲是有效的，是綜合防齲措施的一項重要部分，推薦在一級預防和二級預防對早期齲干預措施時采用窩溝封閉。由于證據有限，無法確定樹脂、玻璃離子、聚酸改性樹脂、樹脂改性玻璃離子類窩溝封閉劑哪一類更優(yōu)[15]。Prathibha等[16]臨床研究報道，樹脂基質封閉劑保留率優(yōu)于玻璃離子封閉劑，在防齲方面沒有取得顯著的結果。玻璃離子水門汀具有良好的生物相容性、生物活性，能釋放氟，與牙體組織的粘附性好，即使在潮濕的條件下也易于處理，非常適合兒童使用，也是在兒牙和修復治療中廣泛應用的原因[17-18]。

ART封閉技術(ART sealants)是指應用高粘度玻璃離子如Ketac Molar Easy Mix(3M ESPE)和Fuji IX(GC)等[19]，在臨床操作時通過ART指壓技術將封閉劑填壓入窩溝點隙，加深滲入深度，提高材料保留率，窩溝封閉劑預防窩溝齲的能力與封閉劑的保留及其起到物理屏障作用密切[20]。樹脂類窩溝封閉需要對牙合面酸蝕[15]，清洗后去除釉質表面溶解的礦物質，形成微孔，有利于封閉劑材料在窩溝中的滲透[21]。較早時建議對乳牙的酸蝕時間比恒牙長一倍，有研究使用不同的酸蝕時間對封閉劑的保留沒有明顯差異，從兒童合作來考慮，酸蝕時間越短唾液污染的概率越低[19]，通常建議恒牙20～30 s，乳牙30～60 s[22]，本文實驗采用酸蝕時間為40 s。

Liu等[23]24個月的臨床研究結果，ART玻璃離子窩溝封閉部分和完全脫落率高于樹脂類封閉劑。我們分析認為，ART封閉術與ART充填術高粘度玻璃離子材料的放置部位不同，ART封閉術放置位置是無機成分高于牙本質的牙釉質，采用的配套液體為牙本質處理劑[18]，用于牙釉質表面處理，因其成分為10%的弱酸類聚丙烯酸[16]，處理10 s不能對窩溝釉質表面微結構產生足夠的影響，如果在ART封閉方案中增加磷酸酸蝕技術，與采用樹脂基類窩溝封閉材料相比較，雖然需要酸蝕、粘結系統(tǒng)，增加光固化設備和操作時間，但其成本低，可提高玻璃離子封閉材料在窩溝表面的保留率，取得更好的防齲效果。本文實驗結果，酸蝕組微滲漏評分明顯低于液體組，微拉伸強度明顯高于液體組，均有顯著性差異(P<0.05)，酸蝕組封閉劑與窩溝壁之間微間隙寬度明顯小于處理液組(P<0.01)。以上結果提示我們改進傳統(tǒng)ART封閉方案，采用酸蝕處理窩溝表面釉質，產生微孔結構，有利于封閉材料的滲入，增強與窩溝的結合與固位力。

Zhang等[6]報告采用酸蝕處理能顯著提高Ketac?Molar Easymix, Fuji Ⅰ玻璃離子和樹脂改性玻璃離子與牛牙釉質微拉伸強度(P<0.05)。電鏡研究觀察酸蝕后釉質表面出現典型的蝕刻模式，玻璃離子突延伸滲入釉質，在界面之間形成厚的嵌合層(hybrid layer)。使用配套玻璃離子液體處理釉質表面后，去除了玷污層，釉柱間質溶解，但沒有出現典型的蝕刻模式[6]，說明酸蝕處理改變釉質表面微結構，形成密集的微孔結構增加了封閉材料滲入釉質，擴大了接觸面和深度形成嵌合層。本文實驗電鏡觀察結果：①酸蝕處理后乳磨牙牙合面高倍電鏡照片顯示釉質表面釉柱間質脫礦，呈現典型蝕刻結構，液體處理后樣本表面玷污層清除，粗糙呈細小的蜂窩微孔結構。②兩組低倍電鏡照片封閉劑均填滿窩溝，可見封閉劑與窩溝壁之間細小、斷續(xù)的縫隙。③酸蝕處理后高倍電鏡照片觀察到玻璃離子封閉材料與釉質之間長的嵌合層片段和斷續(xù)、窄的縫隙。處理劑組電鏡照片玻璃離子封閉材料與釉質結合部位僅少量嵌合點、縫隙寬而長，提示釉質酸蝕后形成的微孔結構加上指壓技術[24]，有助于高粘性玻璃離子封閉劑的與釉質微孔結構產生嵌合增加微機械固位力，酸蝕組微拉伸強度顯著高于處理劑組(P<0.05)。

玻璃離子封閉劑能緩慢釋放氟化物和礦物離子到牙齒最容易患齲的部位，當玻璃離子流失時，部分材料仍存留在窩溝深處，以提供機械保護，并持續(xù)釋氟[3]。高粘度玻璃離子表現出更高的初期和持續(xù)的氟釋放作用[25]。Feroz等[26-27]體外研究報告，GC Fuji Ⅰ和3M Ketac Molar兩種玻璃離子材料能有效降低變形練球菌的菌落計數，抑制和殺滅變形鏈球菌效果最好。

一項乳磨牙窩溝封閉的臨床觀察中，實驗組采用35%磷酸酸蝕處理乳磨牙牙合面，對照組采用玻璃離子配套的液體處理乳磨牙牙合面，觀察12個月后酸蝕組封閉劑保留情況優(yōu)于處理液組，患齲情況顯著低于處理液組(P<0.05)[28]，本文實驗結果也提示，酸蝕后在釉質表面形成的微孔結構，有利于玻璃離子進入，增加與釉質結構的嵌合,顯著減少微滲漏，增強微拉伸力，可以提高封閉劑的保留率和防齲效果。