翁清清，易芳羽，郁 瑩，葛蘇鈺，張 穎

氟牙癥(dental fluorosis)是慢性氟中毒在人體內(nèi)最早出現(xiàn)的臨床表征[1]，主要表現(xiàn)為釉質(zhì)的白堊斑、著色、缺損樣改變及嚴(yán)重的磨損等，影響了許多患者的身心健康。2015年第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示全國(guó)12歲年齡組氟牙癥患病率為13.4%[2]，較十年前11.7%的患病率有所上升[3]。截至2017年，全國(guó)氟牙癥患病人數(shù)2 700萬(wàn)余人[4]。氟牙癥病因明確，但具體的致病機(jī)制尚不明確。前期有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的成釉細(xì)胞在過(guò)量氟刺激下存在自噬(autophagy)，能在一定程度保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，且具有劑量依賴性[5-6]，但缺乏體內(nèi)驗(yàn)證的研究報(bào)道。因此，本研究利用Wistar大鼠飲用不同濃度含氟水建立氟牙癥大鼠模型，通過(guò)腹腔注射自噬抑制劑3-MA干預(yù)大鼠自噬水平，通過(guò)檢測(cè)大鼠切牙成釉細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和p62蛋白的表達(dá)改變和細(xì)胞凋亡水平，探索自噬在氟牙癥大鼠切牙成釉細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡Wistar大鼠48只，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：北京SYXK(京)2016-0011)。

1.1.2 主要試劑設(shè)備 Beclin1多克隆抗體(ab207612，Abcam)，LC3B多克隆抗體(ab48394，Abcam)，p62多克隆抗體(ab56416，Abcam)，Cleaved Caspase-3 多克隆抗體(9661，CST)，3-MA(S2767，Selleck)；石蠟切片機(jī)(LEICA RM2016，德國(guó))，石蠟包埋機(jī)(KD-BM，中國(guó))。

1.1.3 動(dòng)物模型建立 大鼠在上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(滬)2019-0003)，適應(yīng)環(huán)境1周后，采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，雌雄各半。A組：飲用常規(guī)飲用水，腹腔注射1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)；B組：飲用氟離子濃度為75 mg/L的飲用水，腹腔注射1 mL PBS；C組：飲用氟離子濃度為150 mg/L的飲用水，腹腔注射1 mL PBS；D組：飲用常規(guī)飲用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；E組：飲用氟濃度為75 mg/L的飲用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；F組：飲用氟濃度為150 mg/L的飲用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；腹腔注射給藥每隔2 d于上午9點(diǎn)進(jìn)行。各組大鼠自由飲水飲食，共飼養(yǎng)8周。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 大鼠飼養(yǎng)8周后二氧化碳窒息處死，切牙拍照后取雙側(cè)下頜骨置于4% 多聚甲醛中固定24 h，隨后用10% 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣，6周后石蠟包埋切片備用。

1.2.2 大鼠切牙HE染色 常規(guī)HE染色觀察各模型組大鼠切牙成釉細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 大鼠下頜骨切片脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，PBS浸泡10 min，3% H2O2溶液浸泡10 min，0.25% Triton X-100破膜15 min；10%山羊血清封閉30 min，一抗按說(shuō)明書(shū)比例稀釋后4 ℃濕盒孵育12 h，室溫復(fù)溫1 h，PBS沖洗2 min × 3次；二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗2 min × 3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液室溫孵育，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，待顯色合適，PBS沖洗2 min × 3次；蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核，分化液分化，脫水封片，于正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在高倍鏡下，每張免疫組化切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，免疫組化陽(yáng)性值定量用Image J軟件分析，得到的數(shù)據(jù)使用采用SPSS 22.0軟件包進(jìn)行雙因素方差分析檢驗(yàn)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況

各組大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，行為活潑，毛色正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致。隨著飲水中氟離子濃度增高，大鼠切牙氟牙癥表現(xiàn)明顯，表現(xiàn)為釉面橫紋、白堊色樣改變，高氟飲水大鼠切牙出現(xiàn)明顯磨損。同時(shí)，相同飲水條件下，腹腔注射3-MA的大鼠下切牙切端磨損明顯(圖1)。

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA圖1 大鼠切牙形態(tài)顏色的改變Fig.1 Changes of morphology and color of rat incisors

2.2 大鼠成釉細(xì)胞形態(tài)改變

大鼠切牙成釉細(xì)胞呈單層柱狀排列，細(xì)胞核遠(yuǎn)離基膜，隨著釉質(zhì)成熟，成釉細(xì)胞高度逐漸降低，寬度變窄。飲水中氟離子濃度增高，部分細(xì)胞核靠近基膜，成釉細(xì)胞下方乳頭層細(xì)胞由正常的乳頭狀變?yōu)闂l索狀。飲用同一濃度含氟飲用水時(shí)，腹腔注射3-MA組的大鼠成釉細(xì)胞排列紊亂，原有高柱狀結(jié)構(gòu)變矮(圖2)。

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA；Bar:250 μm圖2 HE染色顯示大鼠切牙成釉細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變( ×200)Fig.2 HE staining revealed morphological changes of rat incisor ameloblasts ( ×200)

2.3 大鼠成釉細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

免疫組化檢測(cè)各組大鼠下頜骨石蠟切片中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、自噬底物蛋白p62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)的定位和表達(dá)的改變，陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。結(jié)果顯示飲用75 mg/L含氟水的大鼠成釉細(xì)胞中Beclin1表達(dá)增加(P<0.05)，LC3和p62變化不明顯。相較之下，飲用150 mg/L含氟水的大鼠成釉細(xì)胞與正常組對(duì)比，Beclin1、LC3和p62蛋白水平變化均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此外，在相同飲水條件下，腹腔注射3-MA組的大鼠成釉細(xì)胞中LC3和Beclin1蛋白表達(dá)量降低，而p62蛋白表達(dá)量升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3～6)。

與飲用正常水比較，*：P<0.05；飲用相同水情況下，與腹腔注射PBS比較，#：P<0.05A：Beclin1；B：LC3；C：p62；D：Cleaved Caspase-3圖3 大鼠下切牙成釉細(xì)胞中蛋白表達(dá)的定量結(jié)果Fig.3 Quantitative results of protein expression in rat lower incisor ameloblasets

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA;Bar:20 μm圖7 大鼠下切牙成釉細(xì)胞Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平(IHC ×400)Fig.7 Immunohistochemical staining of Cleaved Caspase-3 in rat lower incisor ameloblasts(IHC ×400)

2.4 大鼠成釉細(xì)胞活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示Cleaved Caspase-3在各組大鼠成釉細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在飲用150 mg/L含氟水的大鼠成釉細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，同時(shí)，腹腔注射3-MA使成釉細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3D，圖7)。

3 討 論

氟牙癥是在牙齒釉質(zhì)形成期，長(zhǎng)期接受過(guò)量氟，使成釉細(xì)胞受到損害，造成釉質(zhì)發(fā)育不良[1]，氟牙癥的致病機(jī)制一直以來(lái)受廣大研究者重視[7]。成釉細(xì)胞是上皮來(lái)源的唯一能產(chǎn)生硬組織的細(xì)胞，負(fù)責(zé)調(diào)控釉質(zhì)基質(zhì)的合成、分泌、重吸收和降解，是釉質(zhì)形成的關(guān)鍵[8]。大鼠切牙唇側(cè)可持續(xù)觀察到不同時(shí)期的成釉細(xì)胞，因此本研究采用4周齡Wistar大鼠，分別通過(guò)飲水加75 mg/L和150 mg/L氟離子，喂養(yǎng)8周后，觀察到大部分大鼠出現(xiàn)了明顯的氟牙癥樣改變，提示成功復(fù)制氟牙癥大鼠模型。

自噬是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量控制系統(tǒng)的重要組成部分，外界刺激造成的細(xì)胞器損傷將啟動(dòng)自噬途徑進(jìn)行清除、降解和回收利用，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義[9-10]。自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和p62是自噬的常用標(biāo)志物[11]，Beclin1和LC3參與了自噬體的形成，表達(dá)水平與自噬作用強(qiáng)度相一致。而p62作為溶酶體標(biāo)志物，參與自噬降解過(guò)程，其表達(dá)水平與自噬作用強(qiáng)度相反。Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的重要蛋白，被上游凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活為Cleaved Caspase-3后執(zhí)行細(xì)胞程序性凋亡[12]，因而Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平可以反映Caspase-3的活性和細(xì)胞凋亡情況[13]。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)飲水中氟離子添加量為75 mg/L時(shí)，大鼠切牙出現(xiàn)釉面橫紋，靠近切牙切端的成熟期成釉器組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，乳頭層呈條索狀。此時(shí)，成釉細(xì)胞自噬水平稍有增高，細(xì)胞凋亡不明顯。繼續(xù)加大飲水中氟離子劑量(150 mg/L)時(shí)，大鼠切牙出現(xiàn)明顯磨損，較多成釉細(xì)胞細(xì)胞核偏向基膜。成釉細(xì)胞中Beclin1、LC3和Cleaved Caspase-3表達(dá)增加，p62表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示細(xì)胞自噬水平和凋亡水平明顯增高。研究顯示，隨著飲水中氟離子濃度增高，大鼠成釉細(xì)胞自噬水平逐漸增高[5]，引起成釉細(xì)胞損傷呈劑量依賴性[14]，與本研究結(jié)果一致。自噬和凋亡是重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)周轉(zhuǎn)機(jī)制，兩者之間的相互作用關(guān)系可總結(jié)為[15]：①自噬與凋亡相互獨(dú)立；②自噬抑制凋亡保護(hù)細(xì)胞；③在低劑量刺激下自噬抵抗凋亡保護(hù)細(xì)胞，過(guò)量的刺激下凋亡誘導(dǎo)自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性機(jī)制。到目前為止，尚不能判斷氟刺激下大鼠成釉細(xì)胞中自噬和凋亡的關(guān)系。

在氟牙癥相關(guān)的研究中，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道自噬在過(guò)量氟刺激下成釉細(xì)胞中的表達(dá)水平及作用[5-6,14,16]。為了研究自噬和凋亡之間的作用關(guān)系，本研究采用腹腔注射3-MA的方法，在氟牙癥動(dòng)物模型上抑制自噬，探索抑制自噬對(duì)成釉細(xì)胞凋亡的影響。3-MA是一種選擇性PI3K抑制劑，作用于Vps34和PI3Kγ，可以阻斷自噬體形成，是一種常用的自噬抑制劑[11]。3-MA給藥頻率、劑量和方式與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)，目前尚無(wú)統(tǒng)一的給藥標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)合文獻(xiàn)[17-19]，選用每隔2 d腹腔注射10 mg/kg 3-MA的方式，持續(xù)給藥8周。結(jié)果顯示，3-MA作用后大鼠成釉細(xì)胞中表達(dá)Beclin1和LC3降低，p62表達(dá)增高，提示3-MA抑制了大鼠成釉細(xì)胞自噬水平。與此同時(shí)，自噬抑制使成釉細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯增高，細(xì)胞凋亡增加，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[16]，提示自噬在一定程度上可以抑制凋亡保護(hù)成釉細(xì)胞。近來(lái)，自噬功能障礙加重氟化物引起的細(xì)胞毒性作用也得到了證實(shí)[20-21]。

2014年，Suzuki的研究第一次從細(xì)胞應(yīng)激的角度初步探討了氟作用下成釉細(xì)胞自噬途徑的存在，提出了氟化物刺激沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)并啟動(dòng)自噬以保護(hù)細(xì)胞免受氟化物暴露的傷害[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量氟引起大鼠成釉細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[22-23]，進(jìn)而使細(xì)胞中產(chǎn)生大量錯(cuò)誤折疊的蛋白及一些受損的細(xì)胞器[24]。這些異常大分子和受損細(xì)胞器可以通過(guò)自噬途徑進(jìn)行清除，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，避免細(xì)胞損傷或死亡。然而，自噬在口腔疾病中通常具有雙刃劍的作用[25]，任何過(guò)度的自噬活動(dòng)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的損傷，甚至引起細(xì)胞凋亡和死亡[26]。本研究證實(shí)自噬可以抵抗凋亡從而保護(hù)細(xì)胞，但尚不能明確過(guò)量的氟刺激下是否誘導(dǎo)自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性機(jī)制。

綜上，氟牙癥大鼠成釉細(xì)胞中存在自噬，且高濃度氟刺激對(duì)自噬的誘導(dǎo)作用加強(qiáng)。自噬通過(guò)某種途徑抵抗細(xì)胞凋亡，在一定程度上保護(hù)成釉細(xì)胞免受損傷。本研究為探索氟牙癥的發(fā)病機(jī)制和對(duì)氟牙癥的預(yù)防及干預(yù)提出了一種新的思路，對(duì)于氟化物刺激下成釉細(xì)胞自噬和凋亡之間的關(guān)系，以及自噬具體通過(guò)什么途徑減少大鼠成釉細(xì)胞凋亡仍需進(jìn)一步研究。