劉春輝，鐘 燁，曹文斌，王曉濤，陳建立，王長(zhǎng)友，田 煒，張國(guó)志

0 引 言

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的頭頸部的惡性腫瘤，它主要包括甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，甲狀腺髓樣癌，甲狀腺未分化癌，甲狀腺濾泡狀癌。PTC是甲狀腺腫瘤中最常見(jiàn)的病理類型，其發(fā)病率約占甲狀腺癌的80%以上，主要好發(fā)于女性和兒童[1]。手術(shù)切除是最常采用的治療方法，但是部分患者可出現(xiàn)喉返神經(jīng)損傷和窒息等嚴(yán)重并發(fā)癥，尤其是老人和兒童預(yù)后生活質(zhì)量明顯下降。因此，近年來(lái)有關(guān)基因的靶向治療成為了研究的熱點(diǎn)。研究表明，PTC發(fā)生發(fā)展是由于多個(gè)癌基因的參與及其它各種因素共同導(dǎo)致的結(jié)果[2-3]。叉頭框基因家族主要有FOXA、FOXB～FOXQ等亞家族成員，它是一類功能廣泛且從酵母到人類都廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的叉頭DNA結(jié)構(gòu)域[4-5]。叉頭框Q1(Forkhead box Q1 ,FOXQ1)是FOX家族中重要的成員，該基因自身特定的DNA結(jié)構(gòu)域與目的基因結(jié)合，通過(guò)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控特定蛋白的表達(dá)水平，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用[6-7]。研究表明，F(xiàn)OXQ1在膀胱癌、肝癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中存在異常的高表達(dá)，調(diào)控著腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，尤其在腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過(guò)程中扮演著重要的角色[8-11]。而FOXQ1對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中EMT的調(diào)控作用以及與TGF-β1之間的關(guān)系尚有待于進(jìn)一步的研究。本研究利用小干擾RNA技術(shù)沉默TPC-1細(xì)胞中FOXQ1基因后，觀察細(xì)胞EMT的變化，探討該基因是否參與TGF-β1調(diào)控TPC-1細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)，F(xiàn)OXQ1-siRNA、無(wú)意義序列RAN(蘇州吉瑪基因有限公司)，lipofectamineTM2000和FOXQ1、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin引物(美國(guó) Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，兔抗人FOXQ1多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，單克隆抗體E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin(美國(guó)CST公司)，TGF-β1粉劑(美國(guó)sigma 公司)。高分辨率倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，AI600化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)GE公司)，qRT-PCR儀器(中國(guó)香港Gene Company Iimited公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞用10%～15%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃恒溫的細(xì)胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且傳代次數(shù)在5代以內(nèi)的細(xì)胞用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液(密度為3×105/mL)。首先隨機(jī)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組；然后按照l(shuí)ipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)依次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，陰性對(duì)照組加入lipofectamineTM2000和帶有熒光標(biāo)記的NC-siRNA，干擾組中加入轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000和FOXQ1-siRNA，置于37 ℃細(xì)胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)。6 h后換液，PBS沖洗3遍。收集mRNA和蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)采用qRT-PCR法。首先提取TPC-1細(xì)胞總的RNA，待逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用qRT-PCR儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中各引物序列分別為：FOXQ1-F：5'-ATTTCTTGCTATTGACCGATGC-3'， FOXQ1-R：5'- CCCAAGGAGACCACAGTTAGAG-3'。 E-cadherin-F：5'- TGGCTTCCCTCTTTCATCTCC-3'，E-cadherin-R：5'- CGTGAAGGTTTGCCAGTGTGA-3'。N-cadherin-F：5'- CCTGGCGTTCTTTATCCCG-3'，N-cadherin-R：5'- CGTGAAGGTTTGCCAGTGTGA-3'。Vimentin-F：5'- TCAATGTTAAGATGGCCCTTG-3'，Vimentin-R：5'- TGAGTGGGTATCAACCAGAGG-3'。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件: 預(yù)變性95 ℃ 50 s，變性95 ℃ 5 s， 退火60 ℃ 30s，延伸72 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.5細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)采用蛋白免疫印跡法。轉(zhuǎn)染成功后，首先提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA法檢測(cè)各組蛋白的濃度，蛋白變性后置于-80 ℃長(zhǎng)期保持。蛋白量上樣后SDS-PAGE蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜(90V,50 min),脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗FOXQ1(1∶500)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶1000)、 Vimentin(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)。在室溫下孵育8 h以上，再次洗膜3次，加入二抗室溫下孵育2 h，充分洗膜后ECL熒光顯色并采集圖像。以GAPDH為內(nèi)參，利用Image J軟件分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞黏附能力的檢測(cè)采用濃度為5 μg/mL人纖維蛋白粘連蛋白(FN)100 μL均勻鋪于96孔板后，放入37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h，然后用2%BSA (Albumin Bovine V)封閉1 h，4℃過(guò)夜。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組TPC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104/mL，每孔取100 μL的細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)溶液，37 ℃恒溫箱中繼續(xù)反應(yīng)4 h，吸凈96孔板內(nèi)的液體，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO),37 ℃恒溫箱中震蕩反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)量每孔吸光度(即A值)，A值代表細(xì)胞黏附數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞黏附率計(jì)算公式為：

細(xì)胞黏附數(shù)=陰性對(duì)照組或干擾組/空白對(duì)照組×100%

1.7TGF-β1誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，分別加入TGF-β1(終質(zhì)量濃度5 ng/mL)的培養(yǎng)48 h后，然后提取各組細(xì)胞總的蛋白，Western blot法分別檢測(cè) TGF-β1誘導(dǎo)前后細(xì)胞中蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8細(xì)胞侵襲、遷移能力的檢測(cè)

1.8.1 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)采用Transwell小室遷移試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染24 h后，取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1細(xì)胞，胰酶消化后用1%FBS培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液(2×105/mL)均勻接種于上室內(nèi)，在下室中加入10%～15%FBS DMEM培養(yǎng)基(600 μL/孔)。將Transwell小室放入37 ℃恒溫細(xì)胞箱中常規(guī)培養(yǎng)36 h。棄培養(yǎng)基，清除上室內(nèi)未穿膜的細(xì)胞，PBS沖洗3遍，細(xì)胞固定后用蘇木精染色，在倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野/組，計(jì)算小室膜細(xì)胞數(shù)的平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8.2細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)采用Transwell小室侵襲試驗(yàn)。首先用預(yù)冷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠稀釋，每孔取40 μL稀釋液(濃度為50 mg/L)均勻鋪于Transwell小室面，37 ℃恒溫孵育箱1 h后，紫外線照射下過(guò)夜。其余的步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 小干擾RNA轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞的干擾效果與空白對(duì)照組和NC-siRNA組相比，F(xiàn)OXQ1-siRNA組的FOXQ1的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)；而空白對(duì)照組和NC-siRNA組的mRNA和蛋白表達(dá)量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

2.2細(xì)胞黏附能力的變化FOXQ1-siRNA組細(xì)胞的黏附能力較空白對(duì)照組和NC-siRNA組明顯降低(P<0.05)；空白對(duì)照組和NC-siRNA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

1:空白對(duì)照組; 2:NC-siRNA組; 3:FOXQ1-siRNA組

1:空白對(duì)照組; 2:NC-siRNA組; 3:FOXQ1-siRNA組

1:空白對(duì)照組; 2:NC-siRNA組; 3:FOXQ1-siRNA組

2.3細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平的變化FOXQ1-siRNA組E-cadherin 的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組和NC-siRNA組明顯升高(P<0.001)，而空白對(duì)照組與FOXQ1-siRNA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FOXQ1-siRNA組中N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)量較其他兩組明顯降低(P<0.01)，而空白對(duì)照組與FOXQ1-siRNA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4、圖5。

與空白對(duì)照組和NC-siRNA組比較，*P<0.05

1:空白對(duì)照組; 2:NC-siRNA組; 3:FOXQ1-siRNA組

2.4TGF-β1對(duì)FOXQ1和EMT蛋白的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果示，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FOXQ1蛋白48 h的相對(duì)表達(dá)量較0 h均明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

2.5細(xì)胞的侵襲、遷移能力的變化與NC-siRNA組相比，NC-siRNA+TGF-β1組中細(xì)胞穿透數(shù)明顯增多；而TGF-β1+FOXQ1-siRNA組細(xì)胞穿透數(shù)較NC-siRNA+TGF-β1組明顯減少(P<0.01)；表明FOXQ1-siRNA轉(zhuǎn)染成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和遷移能力。見(jiàn)表1。

圖 6 TGF-β1誘導(dǎo)48 h各組蛋白相對(duì)表達(dá)量

表 1 細(xì)胞遷移和侵襲的變化

2.6沉默F(xiàn)OXQ1基因后可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)化Western blot結(jié)果所示，與NC-siRNA組相比，TGF-β1誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞后NC-siRNA+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin明顯降低，而N-cadherin、Vimentin、FOXQ1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)；沉默F(xiàn)OXQ1基因后，與NC-siRNA+TGF-β1組相比，F(xiàn)OXQ1-siRNA+ TGF-β1組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin、Vimentin、FOXQ1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)；表明FOXQ1-siRNA可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。見(jiàn)圖7。

1:NC-siRNA組; 2:NC-siRNA+TGF-β1組; 3:FOXQ1-siRNA+TGF-β1組

3 討 論

近年來(lái)研究表明，F(xiàn)OXQ1基因在PTC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1可參與調(diào)控腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)的發(fā)生、細(xì)胞增殖以及腫瘤微環(huán)境等多種生物學(xué)功能，與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此有關(guān)FOXQ1基因的靶向治療成為了該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[12-13]。腫瘤EMT的發(fā)生可使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)表型細(xì)胞，從而使腫瘤獲得侵襲和局部癌癥轉(zhuǎn)移的能力，它貫穿于整個(gè)腫瘤的惡性演變過(guò)程，且伴隨著E-cadherin降低或者丟失，N-cadherin和Vimentin的異常高表達(dá)，以及腫瘤細(xì)胞的黏附能力增強(qiáng)[14]。FOXQ1在乳腺癌、胃癌和肺癌等許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的浸潤(rùn)能力及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它可通過(guò)改變鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒2和Twist蛋白的表達(dá)水平介導(dǎo)腫瘤EMT的發(fā)生[15-17]。

小干擾RAN是一種干擾基因表達(dá)的技術(shù)，它可以阻斷特定基因，而不影響正常等位基因的功能；小干擾RAN具有高序列特異性、高穩(wěn)定性和高效率的特征，可精準(zhǔn)地阻斷目的基因的表達(dá)[18-19]。研究表明，在PTC組織FOXQ1的表達(dá)水平明顯高于甲狀腺正常組織，該基因的異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的分期有著密切的關(guān)系[20]。在PTC中，細(xì)胞EMT可以通過(guò)上皮-間質(zhì)化的關(guān)鍵因子ZEB1基因來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性發(fā)展，從而使細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移的能力[21]。本研究通過(guò)小干擾RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭癌TPC-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXQ1-siRNA成功沉默細(xì)胞FOXQ1基因的表達(dá)，同時(shí)伴有上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，表明沉默F(xiàn)OXQ1基因后可逆轉(zhuǎn)TPC-1細(xì)胞EMT。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1信號(hào)通路腫瘤細(xì)胞EMT的關(guān)鍵通路[22]。在結(jié)直腸癌中，TGF-β1可以誘導(dǎo)FOXQ1蛋白的高表達(dá)，以及E-cadherin的蛋白表達(dá)水平降低，Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平升高，并且可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力；沉默F(xiàn)OXQ1基因后阻斷了TGF-β1信號(hào)通路，從而有效地抑制了腫瘤EMT和侵襲遷移能力，證實(shí)FOXQ1是TGF-β1信號(hào)通路的下游重要靶基因[9]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，TGF-β1對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT誘導(dǎo)作用可通過(guò)沉默F(xiàn)OXQ1基因達(dá)到阻斷的目的,且沉默該基因后可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。因此我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在PTC中TGF-β1可誘導(dǎo)上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá)水平升高，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲能力；沉默F(xiàn)OXQ1基因后可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和侵襲遷移能力。這與Zhu等[8]在膀胱癌中靶向沉默F(xiàn)OXQ1基因可抑制或者部分抑制TGF-β1促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用的結(jié)果相一致。

總之,沉默甲狀腺乳頭癌TPC-1細(xì)胞中FOXQ1基因后可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的EMT，并且FOXQ1基因可阻斷或者部分阻斷TGF-β1促進(jìn)甲狀腺乳頭癌TPC-1細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，F(xiàn)OXQ11基因有望成為PTC患者生物學(xué)治療的新靶標(biāo)，從而為臨床上基因聯(lián)合靶向治療提供理論依據(jù)。但FOXQ1基因與TGF-β1信號(hào)通路之間具體的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步深入的研究。