馬聰聰，張九凱，韓建勛，邢冉冉，郝建雄，陳 穎

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

三文魚屬于大中型冷水域洄游魚類，主要分布在太平洋北部及大西洋和北冰洋交界水域。因其肉質鮮美細嫩和高營養(yǎng)價值[1]，近年來逐漸被作為生食料理店的上等原料。因最早出口中國的三文魚主要來自歐洲，所以嚴格意義上來講，傳統(tǒng)的三文魚指的就是大西洋鮭（Salmo Salar）。在我國，三文魚主要食用方式為生食，因此對其新鮮度的要求非常高[2]。目前常用的新鮮度檢測方法有傳統(tǒng)感官評價[3]以及在此基礎上發(fā)展起來的現(xiàn)代化感官仿生識別技術[4-5]、微生物評價[6]和傳統(tǒng)理化分析[7-8]，隨著光譜技術的發(fā)展，具有快速、無損、成本低以及適合在線檢測等特點的紅外光譜、熒光光譜、核磁共振、拉曼光譜等新興無損檢測技術越來越受到人們的關注[9-11]，但這些技術手段通常是從新鮮度變化的終端入手來表征魚類所處的新鮮度狀態(tài)。為進一步探究魚類新鮮度變化的機理，基于質譜和蛋白質組學的新鮮度研究技術逐漸發(fā)展起來。二維電泳耦合質譜技術（two-dimensional electrophoresis coupled mass spectrometry，2DE-MS）即是其中之一。利用二維電泳可以直觀地對比出不同品質魚類中的差異蛋白點，然后通過質譜技術對其進行鑒定，找到變化蛋白，進而分析出貯存過程中新鮮度變化的機理[12-13]，但是二維電泳也存在一定局限性，比如，對于一些酸性蛋白或堿性蛋白不能實現(xiàn)很好的分離。

同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術是一種多肽體外標記技術。該技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經(jīng)高分辨率質譜儀分析，可同時比較多達8 個樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術[14-16]。如Huan Chen等[17]采用iTRAQ技術對不同溫度貯存的桃果實成熟衰老過程中的蛋白進行了研究，結果共找到325 種差異表達蛋白，它們主要參與碳水化合物和能量代謝、脂質代謝、氨基酸代謝、信號轉導、應激反應和防御等生物學過程。Shi Jing等[18]同樣采用該技術對新鮮泥蝦和凍融后泥蝦肌肉中的蛋白進行了對比分析，共找到226 種差異蛋白，并在進一步的生物信息學分析中探明其品質變化的機理。三文魚肉質細膩，在人們日常飲食中占據(jù)越來越大的比重[19-20]，越來越多的方法應用于三文魚新鮮度的檢測和判定，但對其貯存過程中新鮮度變化機理研究較少，因此本實驗采用iTRAQ定量蛋白質組學技術，對0 ℃條件下不同貯存時間三文魚蛋白進行對比分析，為揭示三文魚新鮮度變化機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮三文魚（物種：大西洋鮭；質量：（6.5±0.2）kg；原產(chǎn)國：挪威），于挪威當?shù)夭稉坪罅⒓丛讱?，去除內臟，冰鮮空運至北京海關，然后于3 h內運至實驗室。

尿素 美國Promega公司；硫脲 美國Americo公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 美國Bio-Rad公司；乙腈（色譜純）、胰蛋白酶 美國Thermo Fisher-Pierce公司；10 kDa離心濃縮裝置 美國Sigma公司；Qubit?3.0熒光定量試劑盒 美國Life Invitrogen公司；iTRAQ?Reagent-8Plex試劑盒 美國AB SCIEX公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Nexera X2液相色譜（liquid chromatography，LC）儀日本Shimadzu公司；Triple-TOF 6600高分辨質譜儀美國AB SCIEX公司；Xbridge Peptide BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，300 ?） 美國Waters公司；Durashell-C18高pH反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?） 天津Agela公司；pH計、ME403E型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Qubit?3.0熒光定量儀 美國Life Invitrogen公司；Centrifuge 5418R型離心機、Concentrator plus型真空濃縮儀 德國Eppendorf公司；TissueLyser II組織研磨儀 德國Qiagen公司；Vortex-Genie 2型振蕩器 美國Scientific Industries公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

樣品運至實驗室后，將其去皮、去刺、切成均勻小塊（平均長（5.0±0.5）cm、寬（5.0±0.5）cm），隨機分為4 份裝入密封袋中，置于冰上（0±1）℃保存，分別于第0、5、10、15天取樣，用于iTRAQ蛋白定量分析（圖1）。新鮮對照組（0 d）和不同貯存時間的實驗組（5、10、15 d）分別做兩組平行，依次標記為0 d-1、0 d-2、5 d-1、5 d-2、10 d-1、10 d-2、15 d-1和15 d-2。

圖1 iTRAQ蛋白質組學分析冰鮮三文魚新鮮度流程圖Fig. 1 Flow chart of iTRAQ proteomic analysis for the freshness of chilled salmon

1.3.2 蛋白質提取與定量

樣品取出后經(jīng)組織研磨儀研磨后進行勻漿，準確稱取混合均勻的魚糜1 g，加入15 倍體積的尿素裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲），漩渦混勻后冰浴振蕩提取1 h，結束后于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，收集上清液。利用Qubit?熒光定量試劑盒測定蛋白濃度，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對蛋白質的提取質量和濃度進行驗證。

1.3.3 蛋白質酶解

蛋白定量后，參照Wang Chong等[21]的蛋白處理條件，結合iTRAQ?Reagent-8Plex試劑盒說明書進行蛋白酶解。即分別取含有80 μg蛋白的提取液置于離心管中，分別加入4 μL iTRAQ試劑盒中Reducing Reagent溶液，37 ℃水浴反應1 h，加入2 μL Cysteine-Blocking Reagent，室溫避光放置10 min，將還原烷基化后的蛋白溶液轉移至10 kDa的超濾管中，12 000×g離心20 min，棄掉收集管底部溶液。然后按照酶與底物1∶40的體積比向超濾膜中分別加入2 μg胰蛋白酶，37 ℃條件反應6 h，12 000×g離心20 min，得到酶解后的肽段。

1.3.4 iTRAQ標記

從冰箱中取出iTRAQ試劑，平衡到室溫，向8 管iTRAQ試劑（圖1中編號113～121）中分別加入200 μL異丙醇稀釋，然后與對應的肽段樣品混合（113和114分別標記0 d-1和0 d-2；115和116標記5 d-1和5 d-2；117和118標記10 d-1和10 d-2；119和121標記15 d-1和15 d-2），室溫反應2 h，然后加入100 μL去離子水終止反應?；旌蠘擞浐蟮臉悠罚鰷u振蕩混勻，取出20 μL混合標記肽段，用Ziptip脫鹽后進行Triple-TOF 6600質譜鑒定，以檢測標記效率和質量，其余混合液旋轉真空干燥后冷凍保存待用。

1.3.5 高pH反相色譜分級

將干燥后的標記肽段溶解在1 0 0 μ L 流動相A（20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0）中，用Durashell-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?）進行洗脫。參考華愉教等[22]的第一維高pH反相液相色譜分離條件，對洗脫條件進行優(yōu)化，具體為流速0.8 mL/min，流動相B為體積分數(shù)80%乙腈溶液（含20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0），梯度洗脫程序如下：0～5 min，5% B；5～30 min，5%～15% B；30～45 min，15%～38% B；46 min上升至90% B，并持續(xù)至55 min；55～65 min，5% B?？傁疵摃r間65 min，將前60 min的洗脫液接入60 個1.5 mL離心管中，按極性合并成16 管肽段復合物，真空干燥備用。

1.3.6 高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜分析

參照Wang Zhixiu等[15]的LC-MS條件，對洗脫梯度和質譜去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，然后對樣品肽段進行LC-MS分析。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）條件：色譜柱為Xbridge Peptide BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，300 ?），流動相A為2%（體積分數(shù)，后同）的乙腈溶液（含0.1%甲酸），流動相B為98%的乙腈溶液（含0.1%甲酸）。將16 管分級后的肽段分別用流動相A復溶后進行后續(xù)分析。設定流速0.25 mL/min，梯度洗脫程序：0～1 min，2%～5% B；1～30 min，5%～20% B；30～54 min，20%～42% B；54.5～62 min，80% B；62.1～68 min，2% B。

M S 條件：采用正離子掃描模式，掃描范圍350～1 500 m/z。霧化器：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；氣簾氣：35 psi；離子源溫度：550 ℃；去簇電壓：80 V；離子碰撞能量：10 V。

1.3.7 蛋白質鑒定

使用ProteinPilot 5.0.2軟件對分級后的16 管肽段質譜鑒定結果進行合并和數(shù)據(jù)轉換，利用Excel軟件對蛋白可信肽段數(shù)和覆蓋率進行統(tǒng)計和展示說明。三文魚物種原始蛋白庫于Uniprot（http://www.uniprot.org）上進行下載，共含有88 995 條目標肽段序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

差異表達蛋白篩選標準：P＜0.05，即對兩次重復數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05的蛋白認為差異顯著；差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于1.2或小于0.83，即倍數(shù)變化大于1.2（上調）或小于0.83（下調）認為是差異蛋白[21]，利用Origin 9.0軟件對目標蛋白進行火山圖繪制，并用顏色進行標注（紅色代表上調，綠色代表下調），進行后續(xù)分析。

利用歐洲生物信息研究所維護的QuickGO（http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）注釋工具對差異蛋白進行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋[23]，然后利用在線分析工具Omicshare（https://www.omicshare.com/tools）對每個GO條目下富集的差異蛋白進行統(tǒng)計和計算，隨后采取超幾何檢驗方法確定出差異蛋白中顯著富集的GO條目。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）對差異蛋白質進行代謝通路分析[21]。

2 結果與分析

2.1 三文魚肌肉蛋白基本信息

質譜數(shù)據(jù)經(jīng)過ProteinPilot 5.0.2軟件的搜索和篩選后共獲得10 828 個二級譜圖，匹配到3 355 個肽段，對應257 個蛋白質，其中可信蛋白150 個。對iTRAQ數(shù)據(jù)進行進一步整理分析發(fā)現(xiàn)這150 個蛋白中，有8 個只含有1 條可信肽段，其余142 個蛋白至少含有兩條可信肽段（圖2A）。此外，如圖2B所示，有42%的蛋白質序列覆蓋率即質譜檢測出的肽段氨基酸序列占整個蛋白序列的比率超過50%，結果表明蛋白質組學分析是可靠的。

圖2 三文魚蛋白包含的可信肽段數(shù)量（A）和蛋白序列覆蓋度（B）Fig. 2 Statistics of the number of trusted peptide segments of proteins (A)and protein sequence coverage (B) in salmon

2.2 差異蛋白篩選與分析結果

圖3 0 ℃條件下三文魚貯藏不同時間后的差異蛋白火山圖和韋恩圖Fig. 3 Volcanic maps and Venn map of differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

差異蛋白的篩選條件為“FC大于1.2或小于0.83，P＜0.05”。由差異蛋白火山圖（圖3A～C）可以直觀地看出上調蛋白和下調蛋白分布情況。與貯藏0 d冰鮮三文魚樣品相比，在3 個不同貯存時間的處理組中共找到62 個差異蛋白，其中有29 個蛋白在貯存5 d后發(fā)生了顯著變化，22 個貯存10 d后發(fā)生了變化，52 個在貯存15 d后發(fā)生了變化，結果表明隨著貯存時間的延長，蛋白變化速率加快。另外，利用韋恩圖（圖3D）對這些蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，有12 個差異蛋白在3 個處理組中均被篩選出來；有6 個蛋白在貯存前5 d沒有明顯變化，但貯存10 d后開始出現(xiàn)上調或下調，隨著生化過程的進行，有24 個蛋白直到貯存15 d后才發(fā)生明顯變化，可能是由于貯存過程中，一些代謝產(chǎn)物積累而誘發(fā)了新的生物反應過程；10 個蛋白隨著貯存時間的延長出現(xiàn)了先增多后減少或先減少后增多的變化趨勢，進一步證明了蛋白變化與貯存時間具有密切聯(lián)系。這些蛋白可能是與冰鮮三文魚品質密切相關的潛在蛋白質生物標志物。

2.3 差異蛋白生物信息學分析結果

圖4 0 ℃條件下貯存5、10 d和15 d后三文魚差異蛋白GO功能注釋圖Fig. 4 Gene ontology annotation of di-erentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

通過GO注釋分析可以對差異蛋白行使的主要生物學功能進行分類，對3 個比較組的差異蛋白進行GO注釋發(fā)現(xiàn)，3 組差異蛋白主要參與的生物學進程均包括代謝過程、細胞過程和單有機體過程（圖4）；在細胞組分分類中，主要參與細胞、單元部分、高分子絡合物以及細胞器組成。在分子功能方面，5 d/0 d比較組中的29 個差異蛋白主要具有催化活性，然后依次為離子結合和ATP/ADP結合；10 d/0 d比較組中的22 個差異蛋白前三大功能依次為催化活性、ATP/ADP結合和核苷酸結合；15 d/0 d比較組的52 個差異蛋白中，主要參與離子結合，ATP/ADP結合、催化活性和核苷酸結合也占較大比例。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析了不同蛋白質的代謝途徑（表1）。發(fā)現(xiàn)62 個差異蛋白共參與了56 個代謝途徑。其中5 d/0 d和15 d/0 d比較組中的差異蛋白主要富集在代謝通路、糖酵解/糖異生通路、碳代謝通路和氨基酸生物合成通路；10 d/0 d比較組中的差異蛋白重點參與代謝通路、糖酵解/糖異生通路、碳代謝通路和緊密連接通路。

表1 0 ℃條件下貯存5、10 d和15 d后三文魚差異蛋白顯著富集的KEGG通路Table 1 Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway with significant enrichment of differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

2.4 差異蛋白與新鮮度相關性分析結果

表2 0 ℃條件下貯存5、10 d和15 d后三文魚差異蛋白信息Table 2 Information about differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

續(xù)表2

對3 個比較組的差異表達蛋白進行了綜合分析，共篩選出28 個與三文魚貯存期間品質變化相關的蛋白（表2），其中2 個蛋白在儲存初期上調，但隨著儲存時間的延長開始降解；10 個蛋白在儲存5 d時就發(fā)生了顯著下調，隨著儲存時間的延長繼續(xù)發(fā)生不同程度的降解；3 個蛋白在儲存5 d時沒有發(fā)生明顯變化，但儲存10 d后開始減少；13 個蛋白在儲存10 d以內含量不變，但儲存15 d后發(fā)生明顯降解。結合生物信息學分析結果，發(fā)現(xiàn)它們分別與糖代謝、肌肉收縮、骨架蛋白、能量代謝及脂肪代謝和肽鏈延伸等功能相關。

2.4.1 糖代謝相關蛋白分析結果

與糖代謝相關的蛋白有7 個，分別為果糖二磷酸醛縮酶（A0A1S2WZE0）、葡萄糖-6-磷酸異構酶（A0A1S3PV75）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（B5DGR3）、磷酸甘油酸激酶（B5DFX8）、磷酸甘油酸變位酶（B5DGT9）、磷酸丙糖異構酶（B5DGL3）和α-1,4-葡聚糖磷酸化酶（B5DG55）。以上差異蛋白均為糖酵解和糖異生途徑中重要的催化酶，在貯存第5天開始下調，這主要是由于魚體死后，血液循環(huán)停止，機體不再供氧，但有氧酵解被無氧酵解替代，使肌肉組織中糖代謝過程仍然能維持一段時間，因此短時間內肌肉具有一定的生理活性，相關的催化酶被不斷消耗，貯存初期出現(xiàn)緩慢下調。但隨著貯存時間的延長，糖原不斷減少，乳酸積累，魚體pH值逐漸下降，糖代謝相關的催化酶被鈍化，反應過程停止，進一步導致相關的催化酶被分解，含量出現(xiàn)顯著下調。

2.4.2 肌肉收縮相關蛋白分析結果

與肌肉收縮相關的蛋白有9 個，分別為肌球蛋白重鏈（A0A1S3M1A4）和肌球蛋白-6（A0A1S3R4R2）、肌球蛋白輕鏈（B5DH12）及其亞型（B5DGT2、B5DGT1）、肌球蛋白調節(jié)性輕鏈（Q7ZZN0）、肌鈣蛋白-T（B5DH00）和LDB3蛋白（A0A1S3N253、B5DGH1）。肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成單位，由兩條肌球蛋白重鏈、兩條肌球蛋白輕鏈和兩條調節(jié)性輕鏈構成，在肌肉收縮中起重要作用[24]。魚體死后初期進入僵直階段，肌原纖維產(chǎn)生收縮張力，肌節(jié)中的Z線在持續(xù)的張力作用下斷裂，肌原纖維小片化程度增大；因此隨著貯藏時間的延長，肌球蛋白等會不斷降解。在本研究中發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白重鏈和肌球蛋白-6在貯存第5天就發(fā)生了明顯降解，肌球蛋白輕鏈及其亞型、肌球蛋白調節(jié)輕鏈在貯存后期也發(fā)生顯著下調，這與Shi Jing等[18]的研究結果一致，符合魚體死后蛋白變化規(guī)律。另外，LDB3蛋白是肌原纖維結構中的一個連接蛋白，通過其LIM域將蛋白激酶C介導的信號耦合到細胞骨架上。三文魚在0 ℃貯藏過程中，該蛋白質含量迅速下降，主要因為魚體死后，細胞滲透壓升高，導致肌原纖維結構脆弱，使其更易受到水解酶的作用而降解，進而導致相關蛋白減少。該結果與李婷婷[25]對大黃魚新鮮度研究的結果一致。

2.4.3 骨架蛋白分析結果

在三文魚貯存期間發(fā)生明顯變化的骨架蛋白有3 個，分別為角蛋白（A0A1S3LJL5）、肌原調節(jié)蛋白（B5DFZ6）和肌聯(lián)蛋白亞型（A0A1S3PNJ9）。角蛋白是中間絲蛋白家族（也稱中間纖維）最大的亞群，主要表達于上皮組織中，具有維持細胞形狀的功能。魚體貯存過程中的自溶作用導致結構相關的蛋白降解，為了維持細胞器的穩(wěn)定性，角蛋白含量在貯存前期有增多趨勢；但貯存后期開始下調，是貯存后期降解作用逐漸增大造成的。肌原調節(jié)蛋白是一種骨骼肌Z線蛋白，主要在骨骼肌中表達，而在其他一些組織中的表達水平較低[26]。實驗結果顯示在冷藏過程中，肌原調節(jié)蛋白和肌聯(lián)蛋白均發(fā)生明顯降解，主要與魚肉死后僵直有關，導致肌原纖維的連接和穩(wěn)定性下降，僵直解除后，魚肉硬度下降、嫩度提高，使組織蛋白酶更容易作用于結構蛋白，進而導致肌肉彈性變差，品質開始劣變，Wang Chong等[21]利用iTRAQ定量技術對冰點貯存的縊蟶（Razor clam）進行差異蛋白分析，同樣發(fā)現(xiàn)肌聯(lián)蛋白與貯存時間呈負相關。

2.4.4 能量代謝相關蛋白

魚體死后糖酵解的速率是由ATP酶活性控制的，ATP酶活力大小直接影響新陳代謝的能力，進而影響魚肉品質[27]。參與三文魚貯存過程中能量代謝的差異蛋白有6 個，其中ATP合酶（A0A1S3NPS0、B5RI36）、ADP/ATP轉位酶（B5DGZ1）、線粒體型肌酸激酶（B5DFT9）、腺苷酸激酶同工酶（B5DGM6）顯著下調，AMP脫氨酶（B5DFU7）在貯存初期出現(xiàn)微量上調，然后隨著貯存時間的延長含量趨于不變。魚體死后，肌肉組織中開始進行無氧酵解，每分子葡萄糖氧化產(chǎn)生的ATP數(shù)由原來的39分子減少到3分子，ATP含量急劇下降，因此導致ATP合酶和ADP/ATP轉位酶含量減少。線粒體型肌酸激酶與肌肉收縮、能量合成和能量傳遞直接相關，能可逆地催化肌酸和ATP之間的轉磷酸化反應。該蛋白在貯藏過程中豐度降低，這可能與魚體死后肌酸的降解有關。腺苷酸激酶同工酶在細胞能量平衡和腺嘌呤核苷酸代謝中起著重要作用。定量結果發(fā)現(xiàn)該蛋白在貯存后期出現(xiàn)明顯降解，也主要與葡萄糖無氧降解導致ATP產(chǎn)生量急劇減少有關，與冰點貯存的縊蟶（Razor clam）肌肉蛋白中腺苷酸激酶變化趨勢[21]一致。魚體死后，ATP會分解成多種代謝物，包括二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、一磷酸肌苷（inosine monophosphate，IMP）、次黃嘌呤核苷（inosinecreatinine，H x R）和次黃嘌呤（h y p o x a n t h i n e，H x），主要步驟為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，其中AMP→IMP為限速步驟，IMP經(jīng)歷積累和快速降解過程[28]，AMP脫氨酶主要催化AMP脫氨生成IMP，本實驗結果發(fā)現(xiàn)AMP脫氨酶在貯存5 d時含量升高，10 d后下降，可能與IMP變化規(guī)律有關。

2.4.5 脂肪代謝相關蛋白

載脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I precursor，apoA-I）是高密度脂蛋白中最重要的載脂蛋白。在脂質的攝取、轉運以及脂肪代謝調節(jié)過程中具有重要作用，作為脂肪傳感器來調節(jié)脂肪代謝酶的轉錄[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)apoA-I在貯存10 d內沒有發(fā)生明顯降解，但在15 d后含量減少，應該是受脂肪酸代謝影響。

2.4.6 肽鏈延長與分解相關蛋白

泛素是一種存在于所有真核生物（大部分真核細胞）中的小蛋白，它的主要功能是標記需要分解掉的蛋白質，使其被26S蛋白酶體降解。在貯存前10 d，該蛋白含量沒有明顯變化，主要是由于三文魚貯藏過程中生化過程減弱，各蛋白分解作用加強，泛素一直保持活躍狀態(tài)；貯存15 d后含量明顯下降，主要是后期酶和微生物作用導致的。真核細胞延伸因子是一類在蛋白質合成過程中發(fā)揮肽鏈延伸作用的重要分子，只在骨骼肌、心臟和神經(jīng)元中表達[31]，GO注釋表明其主要的分子功能是促進核苷酸結合，與蛋白合成密切相關。該蛋白在貯存初期就發(fā)生明顯降解，貯存15 d后幾乎消失，主要是由于魚體死后蛋白分解過程加速，合成停止，真核細胞延伸因子生物作用消失，逐漸被內源性酶和微生物分解。

3 結 論

本實驗采用iTRAQ技術對0 ℃條件下貯存不同時間的三文魚新鮮度進行了研究，篩選出28 個可能與三文魚貯存期間品質變化相關的差異蛋白，并將其分為6 類進行了詳細的代謝通路分析。這些蛋白均隨著貯存時間的延長發(fā)生不同程度的下調和上調，并與魚體死后僵直和解僵、葡萄糖無氧酵解、細胞器穩(wěn)定、肌肉收縮和蛋白合成與分解密切相關，因此可以作為研究三文魚新鮮度變化的潛在差異蛋白。為深入了解0 ℃條件下不同貯存時間的三文魚品質變化機理提供了一定的參考，下一步可針對代謝產(chǎn)物進行進一步分析，以發(fā)現(xiàn)三文魚品質劣變過程中相關的風味物質變化規(guī)律。