張 磊 胡建軍

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091)

楊樹(shù)(Populus)作為我國(guó)主要的能源林、紙漿用材林、生態(tài)防護(hù)林樹(shù)種，易受舞毒蛾(Lymantriadispar)、楊尺蠖 (Apocheimacinerarius)等鱗翅目(Lepidopteron)昆蟲(chóng)危害(Wangetal.,1996)。殺蟲(chóng)劑等化學(xué)防治雖能有效防控，但成本高，長(zhǎng)期使用對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性影響深遠(yuǎn)?；蚬こ谭椒榭瓜x(chóng)楊樹(shù)新品種培育提供了潛在的途徑。

蘇云金芽孢桿菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)可在不傷害人、動(dòng)物或有用的寄生昆蟲(chóng)的情況下將昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞插入靶膜并形成氣孔，從而裂解中腸上皮細(xì)胞損害舞毒蛾等幼蟲(chóng)的消化系統(tǒng)(Whiteleyetal.,1986；Vachonetal.,2012；Hilbecketal.,2018)。目前，Bt已成功轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)、棉花(Gossypiumspp.)、水稻(Oryzasativa)、甘薯(Dioscoreaesculenta)、楊樹(shù)等植物(田穎川等，1991;戴小楓等,1997；Zhongetal.,2019)。1989年中國(guó)獲得首例轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因歐洲黑楊(P.nigra)，田間試驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因楊對(duì)楊尺蠖和楊夢(mèng)尼夜蛾(Orthosiaincerta)具有很強(qiáng)抗性同時(shí)兼具生長(zhǎng)快的特性(田穎川，1993；Wangetal.,1996;Huetal.，2001;2014)。丹紅楊(P.deltoides‘Danhong’)與轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊雜交子代對(duì)舞毒蛾有顯著抗性，且生長(zhǎng)優(yōu)良(張春玲等,2008;賈會(huì)霞等,2017)。目前，我國(guó)已培育歐美楊、美洲黑楊、小黑楊、毛白楊(P.tomentosa)等10多個(gè)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊，其中轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊和轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因741楊[P.alba× (P.davidiana+P.simonii) ×P.tomentosa] 2個(gè)抗食葉害蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)品種已進(jìn)入了商業(yè)化應(yīng)用階段，并在2014年種植轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊490 hm2，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)人工林有效地抑制了目標(biāo)害蟲(chóng)的快速傳播，并大大減少了殺蟲(chóng)劑的數(shù)量(胡建軍等,2010;Huetal.,2014)。因此抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊生態(tài)環(huán)境安全性研究具有重要意義，雖然田間試驗(yàn)已表明轉(zhuǎn)BtCry1Ac楊樹(shù)的花粉傳播距離有限，并且在大量非轉(zhuǎn)基因雄性存在下，成功產(chǎn)生Bt后代的發(fā)生概率非常少(Huetal.,2017)，但外源BtCry1Ac基因在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中的穩(wěn)定性及插入位點(diǎn)是安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一。

T-DNA插入位點(diǎn)可能影響目的基因、插入位點(diǎn)上下游基因的表達(dá)情況，側(cè)翼序列的分析對(duì)研究轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的遺傳穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)基因植物的安全生產(chǎn)具有重要意義(許文濤等,2008;王曉波等,2010)。目前插入位點(diǎn)鑒定方法主要有高效熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR 法 (high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR，hiTAIL-PCR)和全基因組重測(cè)序技術(shù)。hiTAIL-PCR具有特異性高、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，已成功應(yīng)用于水稻、油菜(Brassicanapus)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)等多種轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)(Zhangetal.,2011；申愛(ài)娟等，2014；郭超等，2017；蔡勤安等，2018)。本研究以我國(guó)首個(gè)轉(zhuǎn)基因BtCry1Ac楊為研究材料，利用hiTAIL-PCR技術(shù)確定外源基因側(cè)翼序列，建立特異性檢測(cè)方法，并對(duì)T-DNA插入位點(diǎn)上下游基因表達(dá)量檢測(cè)，旨在為轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)外源基因檢測(cè)提供合理有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因歐洲黑楊2個(gè)高抗株系(n12、n222)、丹紅楊× n222雜交子代(B3-44、B3-102、B3-132、B3-153)、非轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊CK3、丹紅楊為試驗(yàn)材料。n12包含BtCry1Ac基因全長(zhǎng)3 534 bp，n222包含BtCry1Ac基因N端1 836 bp，以上植物材料均保存于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院玉泉山實(shí)驗(yàn)苗圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 側(cè)翼序列擴(kuò)增 2019年4月采集轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)及對(duì)照新鮮葉片并利用CTAB法提取DNA，以Bt-F、Bt-R為引物PCR鑒定轉(zhuǎn)基因材料。采用hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增T-DNA側(cè)翼序列，其中簡(jiǎn)并引物 LAD1、LAD2、LAD3、LAD4 的序列參考文獻(xiàn)(Liuetal.,2007)，根據(jù)載體設(shè)計(jì)左右邊界引物L(fēng)B-0A/LB-1A/LB-2A、RB-0A/RB-1A/RB-2A(表1)，并進(jìn)行3輪PCR反應(yīng)。LB-0A/RB-0A分別與LAD1、LAD2、LAD3、LAD4進(jìn)行第1輪PCR；將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋40倍為模板，LB-1A/RB-1A與AC1為引物進(jìn)行第2輪PCR；將第2輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍為模板，LB-2A/RB-2A與AC1為引物進(jìn)行第3輪PCR。具體反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)(Liuetal.,2007)。將第2、3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳，利用Takara切膠回收試劑盒回收第3輪產(chǎn)物，連接pMDTM19-T Vector，送北京賽默飛世爾公司測(cè)序。

1.2.2 序列比對(duì)與分析 利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)識(shí)別載體及基因組序列，基因組序列與毛果楊(P.trichocarpa)基因組(3.0)(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)比對(duì)分析，確定插入位點(diǎn)。利用ePlant(http:∥bar.utoronto.ca/eplant_poplar/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取插入位點(diǎn)上下游基因不同組織表達(dá)譜。

1.2.3 轉(zhuǎn)BtCry1Ac楊PCR 特異性檢測(cè) 根據(jù)插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，特異性PCR 檢測(cè)反應(yīng)在25 μL 體系中進(jìn)行：1 μL 10 μmol·L-1正向引物，1 μL 10 μmol·L-1反向引物，1 μL T-DNA 特異性引物(表1)。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)。

表1 插入位點(diǎn)引物序列Tab.1 Primer sequences for insertion sites

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用天根RNA試劑盒提取CK3、丹紅楊、轉(zhuǎn)基因楊嫩葉總RNA，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)提取RNA的完整性。利用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)合成cDNA。利用Primer3.0(http:∥primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物，以Actin為內(nèi)參基因?qū)Σ迦胛稽c(diǎn)上下游基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(表2)。3次生物學(xué)重復(fù)及4次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并利用Excel作圖。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Tab.2 Primer sequence for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株鑒定

對(duì)含BtCry1Ac基因pBIN437質(zhì)粒測(cè)序獲取抗蟲(chóng)楊插入T-DNA的完整信息(圖1A)。對(duì)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)進(jìn)行PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊n12、n222及其與丹紅楊雜交子代均擴(kuò)增獲得與陽(yáng)性對(duì)照相同的目的條帶，而未轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊、丹紅楊未擴(kuò)增出目的條帶，同時(shí)半定量結(jié)果表明BtCry1Ac基因在轉(zhuǎn)基因株系穩(wěn)定表達(dá)，證明轉(zhuǎn)基因材料中含有BtCry1Ac基因(圖1)。

圖1 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株及轉(zhuǎn)基因表達(dá)量Fig.1 PCR detection of transgenic plants and expression level of BtCry1AcA：pBIN437質(zhì)粒圖譜；B：轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測(cè)；C：BtCry1Ac基因半定量PCR檢測(cè)。M:DL2000 DNA marker;1-8依次為CK3、丹紅楊、n12、n222、B3-44、B3-102、B3-132、B3-153(B3:丹紅楊×n222)。A:T-DNA of vector pBIN437;B:PCR detection of transgenic poplar;C:Semi-quantitative PCR analysis of the BtCry1Ac.M:DL2000 DNA marker;1-8:CK3,Populus deltoides ‘Danhong’,n12,n222,B3-44,B3-102,B3-132,B3-153(B3:P.deltoides ‘Danhong’×n222).

2.2 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n12的T-DNA插入位點(diǎn)

將轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊株系n12右邊界 hiTAIL-PCR 的第2輪和第3 輪擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，以AC1、RB-1A為引物的第2輪和AC1、RB-2A為引物的第3輪擴(kuò)增結(jié)果如圖2A所示。隨機(jī)引物L(fēng)AD3第3輪產(chǎn)物應(yīng)比第2輪小80 bp(圖2A)。將隨機(jī)引物L(fēng)AD3的第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收連接T載體，并測(cè)序獲得215 bp DNA片段，與毛果楊數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中102 bp與15號(hào)染色體10162773-10162874 bp區(qū)段序列完全一致。初步確認(rèn) T-DNA 在歐洲黑楊中的整合位點(diǎn)為Potri.015G076600第2個(gè)內(nèi)含子(即15號(hào)染色體10162773 bp)。利用RB-2A和RB-F擴(kuò)增獲得較長(zhǎng)右翼序列709 bp，1-133 bp與pBIN437載體右邊序列完全一致，134-709 bp為Potri.015G076600序列，RB缺失24 bp(5′-GTTTACCCGCCAATATA TCCTGTC-3′，圖2B)，576 bp的基因組AT堿基含量為64%左右。

圖2 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n12右邊界序列Fig.2 Right boundary sequence of transgenic P.nigra n12 with BtCry1Ac A:轉(zhuǎn)基因株系n12右邊界hiTAIL-PCR電泳結(jié)果(M:DL2000 DNA marker;LAD1、LAD2、LAD3、LAD4為簡(jiǎn)并引物;2:AC1與RB-1A為引物PCR產(chǎn)物;3:AC1與RB-2A為引物PCR產(chǎn)物);B:n12右邊界序列及拼接位置特征。A:The hiTAIL-PCR of right boundary in n12(M:DL2000 DNA marker;LAD1,LAD2,LAD3,LAD4 are degenerate primers;2:The PCR products of AC1 and RB-1A;3:The PCR products of AC1 and RB-2A);B:Right-boundary sequence and splicing position characteristics of n12.

2.3 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n222及其雜交子代的T-DNA插入位點(diǎn)

轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊株系n222的4條隨機(jī)引物第2輪和第3輪產(chǎn)物電泳，發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)并引物L(fēng)AD4的第2、3輪產(chǎn)物相差89 bp(圖3A)，將條帶回收連接T載體，并測(cè)序獲得215 bp DNA片段，1-122 bp為載體序列，123-215 bp與毛果楊數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與1號(hào)染色體41596063-41596184 bp區(qū)段序列完全一致，為基因間隔區(qū)。利用LB-F、LB-2A進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增獲得包括1 143 bp基因組序列和122 bp載體序列的片段，載體LB缺失3 bp(5′-TGG-3′，圖3B)，并發(fā)現(xiàn)1 143 bp的基因組序列AT堿基含量約為69%。

圖3 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n222左邊界序列Fig.3 Left boundary sequence of transgenic P.nigra n222A:轉(zhuǎn)基因株系n222左邊界 hiTAIL-PCR電泳結(jié)果(M:DL2000 DNA marker;LAD1、LAD2、LAD3、LAD4為簡(jiǎn)并引物;2:AC1與LB-1A為引物PCR產(chǎn)物;3:AC1與LB-2A為引物PCR產(chǎn)物);B:n222左邊界序列及拼接位置特征。A:The hiTAIL-PCR of left boundary in n222(M:DL2000 DNA marker;LAD1,LAD2,LAD3,LAD4 are degenerate primers;2:The PCR products of AC1 and LB-1A;3:The PCR products of AC1 and LB-2A);B:Left-boundary sequence and splicing position characteristics of n222.

2.4 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊插入位點(diǎn)特異性鑒定

根據(jù)已確定的轉(zhuǎn)基因楊 T-DNA 的整合位點(diǎn)，分別在n12及n222整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因組設(shè)計(jì)正向引物和反向引物RB-F/RB-R、LB-F/LB-R(圖4)。轉(zhuǎn)基因楊n12 RB-F 和 RB-R 引物位點(diǎn)序列長(zhǎng)度為1 159 bp，RB-2A和 LB-F 之間距離為709 bp。轉(zhuǎn)基因楊n222 LB-F 和 LB-R 引物位點(diǎn)序列長(zhǎng)度為1 827 bp，LB-2A和 LB-F之間距離為1 265 bp。

圖4 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n12(上)、n222(下)插入位點(diǎn)序列特異性檢測(cè)引物位置Fig.4 The location of specific primers for insertion site of transgenic P.nigra n12 (top) and n222 (bottom)

以非轉(zhuǎn)基因楊作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因株系n12和n222以 RB-F、RB-2A、RB-R 3條引物進(jìn)行PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在n12擴(kuò)增出709 bp(轉(zhuǎn)基因)和1 159 bp(非轉(zhuǎn)基因)2個(gè)特異性片段，而對(duì)照及n222只能擴(kuò)增出1 159 bp的非轉(zhuǎn)基因特異性條帶；而以LB-F、LB-2A、LB-R 3條引物進(jìn)行PCR時(shí)，n222、雜交子代擴(kuò)增出1 265 bp(轉(zhuǎn)基因)和1 827 bp(非轉(zhuǎn)基因)2個(gè)特異性片段，對(duì)照、丹紅楊、n12均只擴(kuò)增1 827 bp條帶(圖5)。PCR結(jié)果表明，RB-F、RB-2A、RB-R能特異性識(shí)別n12轉(zhuǎn)化事件；LB-F、LB-2A、LB-R能特異性識(shí)別n222及雜交子代轉(zhuǎn)化事件。

圖5 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n12、n222插入位點(diǎn)特異性PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Specific PCR assay for insertion site of transgenic P.nigra n12 and n222A:轉(zhuǎn)基因株系n12右邊界特異性檢測(cè)(M:DL2000 DNA marker;1-4:CK3,n12,n12,n222);B：轉(zhuǎn)基因株系n222左邊界特異性檢測(cè)(M:DL2000 DNA marker;1-8:CK3,P.deltoides ‘Danhong’,n12,n222,B3-44,B3-102,B3-132,B3-153)。A:Specific PCR detection on right boundary in n12(M:DL2000 DNA marker;1-4:CK3,n12,n12,n222);B:Specific PCR detection on left boundary in n222(M:DL2000 DNA marker;1-8:CK3,P.deltoides ‘Danhong’,n12,n222,B3-44,B3-102,B3-132,B3-153).

2.5 轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊插入位點(diǎn)附近基因的表達(dá)

株系n12插入Potri.015G076600第2個(gè)內(nèi)含子，編碼絲氨酸蛋白激酶 (serine-protein kinase,SPK)；下游2.7 kb處為Potri.015G076700 共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變家族蛋白(ataxia telangiectasia mutated family protein,ATM)(Chr15:10165471..10198538)。株系n222及雜交子代插入位點(diǎn)上游10 kb左右為Potri.001G395700(Chr01:41584863..41586527)，下游17 kb處為Potri.001G395800(Chr01:41613393..41617032)。Potri.001G395700編碼異黃酮-7-O-β-葡萄糖苷6″-O-丙二酰轉(zhuǎn)移酶 (isoflavone-7-O-β-glucoside 6″-O-malonyltransferase,IBG)，Potri.001G395800 編碼光敏色素互作因子解旋酶(PIF1-like helicase,PIF)。根據(jù)ePlant數(shù)據(jù)庫(kù)RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)SPK、ATM、IBG在木質(zhì)部、根、葉、花均有表達(dá)，其中木質(zhì)部表達(dá)量最高，而未收錄PIF表達(dá)情況(圖6A)。

熒光定量PCR顯示，T-DNA的插入對(duì)內(nèi)源基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。n12葉片中SPK表達(dá)量上調(diào)，是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誄K3的4.3倍，ATM表達(dá)量下調(diào)，較對(duì)照降低20倍(圖6B)。丹紅楊、n222及其雜交子代IBG、PIF表達(dá)量較CK3均增加，其中B3-153IBG表達(dá)量最高，為CK3的4倍、丹紅楊的2.6倍；n222PIF表達(dá)量最高，為CK3的9.6倍。

圖6 插入位點(diǎn)附近基因表達(dá)分析Fig.6 The expression levels of genes located at the T-DNA insertion sitesA:SPK、ATM、IBG基因組織特異性表達(dá)分析;B:株系n12嫩葉 SPK、ATM表達(dá)分析;C:株系n222及雜交子代嫩葉IBG、PIF表達(dá)分析。DH：丹紅楊。A:Tissue specific expression of SPK,ATM and IBG;B:Relative expression level of SPK and ATM in transgenic P.nigra n12;C:Relative expression level of IBG and PIF in transgenic P.nigra n222 and hybrids.DH：P.deltoides ‘Danhong’.

3 討論

T-DNA主要通過(guò)單鏈缺口修復(fù)模型(single-stranded gap repair model,SSGR)、DNA雙鏈斷裂修復(fù)模型(double-strand break repair model,DSBR)2種整合修復(fù)模型整合進(jìn)入受體基因組(楊琳等,2011)。植物基因組與T-DNA主要通過(guò)同源或非同源末端連接(Yoshiyamaetal.,2013；Hirakawaetal.,2015)。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻及山楊(P.davidiana)的研究中發(fā)現(xiàn)T-DNA偏向插入富含AT、轉(zhuǎn)錄起始、聚腺苷酸化位點(diǎn)等基因組活躍區(qū)域(Barakatetal.,2000;Kumaretal.,2000;Szabadosetal.,2002;Yongetal.,2006)。研究發(fā)現(xiàn)T-DNA異常重組容易引起T-DNA序列的刪除和重復(fù)及植物染色體重排：易位、丟失、倒位和重復(fù)(Nacryetal.,1998;楊琳等,2011)。

本研究通過(guò)hiTAIL-PCR確定轉(zhuǎn)BtCry1A歐洲黑楊株系n12、n222的插入位點(diǎn)。n12定位于Chr15，T-DNA整合進(jìn)入基因組時(shí)，右邊界發(fā)生24 bp缺失；n222定位于Chr01，左邊界缺失3 bp。n12和n222插入位點(diǎn)均位于AT含量較高區(qū)域。但未能獲得n12的左邊界和n222的右邊界。王曉波等(2010)發(fā)現(xiàn)EPSPs基因的整合導(dǎo)致大豆基因組135 kb片段移位。轉(zhuǎn)JERF36、SacB、ZxZF3個(gè)基因歐美楊‘渤豐1號(hào)’(P.euramericana‘Bofeng1’)T-DNA左右邊界缺失同時(shí)發(fā)現(xiàn)載體骨架序列整合入受體染色體(崔旭東,2012)。白樺雜交種(Betulaplatyphylla×B.pendula)轉(zhuǎn)BpCCR1的黃葉突變體的T-DNA插入引起3個(gè)染色體片段易位及40 kb的缺失(冮慧欣,2019)。因此可能由于T-DNA的插入引起基因組或載體骨干序列的變化從而無(wú)法獲得另一側(cè)序列。

外源基因插入位點(diǎn)與其上下游編碼基因距離太近可能會(huì)影響其上下游基因的表達(dá)(郭超等，2017)。例如，水稻BlC893插入位點(diǎn)上游140 bp、下游248 bp均存在編碼基因，T-DNA插入影響基因表達(dá)并導(dǎo)致株高變矮、結(jié)實(shí)率降低等非期望效應(yīng)(魏歲軍，2014；鄧力華等，2014)。水稻J4突變體T-DNA插入導(dǎo)致插入位點(diǎn)附近AK100376基因表達(dá)量顯著下降(劉航等，2017)。本研究中，n12插入位點(diǎn)為Potri.015G076600第2個(gè)內(nèi)含子，其表達(dá)量為CK3的4.3倍，上游2.7 kb 處Potri.015G076700表達(dá)量顯著降低；田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)n12不僅表現(xiàn)抗食葉害蟲(chóng)危害同時(shí)樹(shù)高、胸徑及木質(zhì)素含量等均顯著大于非轉(zhuǎn)基因CK3(Zhangetal.，2018)，這可能是由于T-DNA插入引起基因表達(dá)量變化導(dǎo)致。n222 T-DNA插入位點(diǎn)雖位于基因間隔區(qū)，但其上游10 kb Potri.001G395700和下游17 kb的Potri.001G395800表達(dá)量同樣發(fā)生變化，因此T-DNA插入基因間隔區(qū)仍不可避免地會(huì)對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)造成影響。丹紅楊×n222雜交子代IBG和PIF表達(dá)量發(fā)生不同程度變化，可能由于雜交育種過(guò)程中遺傳物質(zhì)重組使雜交子代表現(xiàn)不同的特性。

4 結(jié)論

本研究分析轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n12、n222 T-DNA插入位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)T-DNA 偏好插入富含AT區(qū)域，同時(shí)T-DNA載體邊界序列缺失，并引起插入位點(diǎn)附近基因表達(dá)量變化。三引物組合鑒定n12和n222特異插入位點(diǎn)，這進(jìn)一步完善了商品化轉(zhuǎn)BtCry1Ac楊的遺傳背景信息，為轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊的應(yīng)用和監(jiān)管提供了技術(shù)基礎(chǔ)。