邱泰坤 安維婕 何紅玉 況凌楓 羅茂丹 蔣立

【摘要】目的：研究芒果苷對(duì)不同血凝素（HA）亞型流感病毒吸附及復(fù)制過(guò)程抑制作用。方法：使用A/Puerto Rico/8/34毒株為骨架，將流感病毒HA基因片段替換為H1、H4、和H7亞型，通過(guò)反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建不同HA亞型的重組流感病毒。使用定量RT -PCR方法檢測(cè)芒果苷在不同給藥方式下病毒復(fù)制情況，從而判斷該藥物對(duì)不同HA亞型流感病毒的抑制作用。結(jié)果：在病毒吸附過(guò)程中加入芒果苷后，使用不合藥物的維持液，病毒的復(fù)制拷貝數(shù)不受影響。然而，在含芒果苷的維持液中，病毒復(fù)制的拷貝數(shù)明顯低于單純病毒對(duì)照組。結(jié)論：芒果苷對(duì)不同HA亞型的流感病毒的吸附過(guò)程沒(méi)有特異性的抑制作用。其作用靶點(diǎn)可能在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】芒果苷 流感病毒 血凝素 吸附

一、背景

流行性感冒（influenza，流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染癥候群。引起該病的病毒，可分為甲，乙，丙三型。其中甲型流感病毒由于其抗原經(jīng)常發(fā)生變異，且傳播迅速，極易造成世界范圍的大流行。近年來(lái)，有關(guān)抗流感病毒中藥的研究日益增多，從中篩選有效成分已成為當(dāng)前新藥研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。

芒果苷（ mangiferin），又名“莞知母寧”，是一種四羥基毗酮的碳糖苷?，F(xiàn)代研究表明芒果苷具有抗炎，抗氧化，抗病毒，保肝利膽，免疫調(diào)節(jié)，抗糖尿病、抗腫瘤等多方面作用。芒果苷抗病毒活性也得到了部分驗(yàn)證。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，芒果苷能夠抑制HIV-1蛋白酶活性，并具有降低皰疹I(lǐng)、II型病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附的作用。體內(nèi)試驗(yàn)研究顯示，芒果苷能夠抑制鴨乙肝病毒感染，且停藥后不易出現(xiàn)反跳現(xiàn)象。在對(duì)抗流感病毒方面，芒果苷能夠明顯延長(zhǎng)小鼠平均存活時(shí)間，具有綜合抑制流感病毒作用。然而這些研究并沒(méi)有詳細(xì)的闡明芒果苷抗流感病毒的分子機(jī)制。本研究將針對(duì)流感病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附及復(fù)制過(guò)程，使用A/Puerto Rico/8/34 （HIN1，PR8）毒株為骨架，將流感病毒HA基因片段替換為H1、H4、和H7亞型。通過(guò)反向遺傳技術(shù)，統(tǒng)一流感病毒內(nèi)部基因。使用定量RT-PCR方法對(duì)病毒繁殖進(jìn)行定量分析，從而判斷芒果苷對(duì)不同HA亞型流感病毒的抑制作用。

二、材料與方法

1.材料

病毒：流感病毒PR8毒株骨架及pHW2000質(zhì)粒由美國(guó)St.JudeChildren Research Hospital，Richard Webby教授惠贈(zèng)。A/Duck/ShanTou/461/2000 （H4N9）HA基因片段由泰國(guó)Mahidol University，Pi-laipan Puthavathana教授惠贈(zèng)。A/Anhui/l/2013 （H7N9）毒株HA基因片段由中國(guó)流感中心舒躍龍教授惠贈(zèng)。

藥物：芒果苷，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2.方法

反向遺傳病毒構(gòu)建：分別將不同亞型HA（H1、H4、H7）克隆到pHW-2000質(zhì)粒上，再分別與流感病毒PR8的其他7個(gè)基因片段質(zhì)粒，使用TransIT⑩-LTI共轉(zhuǎn)染到聯(lián)合培養(yǎng)的MDCK和HEK-293T細(xì)胞中，獲得的重組流感病毒（rgHI-PR8，rgH4-PR8，rgH7-PR8）將進(jìn)一步在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行增殖。

藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將MDCK細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度的芒果苷，37℃5%CO2孵育72小時(shí)后，使用MTT比色法檢測(cè)其對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性，使用Reed-Iuench法計(jì)算半數(shù)中毒濃度（TC50）。

病毒感染性測(cè)定

將MDCK細(xì)胞接種6孔板，病毒行10倍稀釋后接種細(xì)胞中，使用微晶纖維素作為覆蓋系統(tǒng)，培養(yǎng)72小時(shí)，然后使用10%福爾馬林溶液固定，結(jié)晶紫染色液。一個(gè)蝕斑代表一個(gè)病毒體的繁殖后代品系，對(duì)活性病毒顆粒進(jìn)行定量。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（real-time RT-PCR）試驗(yàn)

將病毒培養(yǎng)液使用QIAGEN RNeasy Mini Kit對(duì)病毒RNA進(jìn)行提取。使用QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit -步法real-timeRT-PCR進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體積為20μI，使用流感RNP基因通用引物進(jìn)行病毒核酸擴(kuò)增，上游引物：5-AGA TI'T CCA CCT GCG ACC G一3;下游引物：5-CAG CGG CTC TCT CCA CAA GT一3。以細(xì)胞CAPDH基因?yàn)閮?nèi)對(duì)照，上游引物：5-GGT GAA CCT CCC TGTCAA CG-3;下游引物：5-CTC CCT CCT CCA ACA TGC TG-3。反應(yīng)條件為：42。C 5min，95。C lOsec，95。C 5sec，60。C 34sec，共40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量的方法，△△Ct=（待測(cè)組目的基因Ct值.待測(cè)組內(nèi)參基因Ct值）.（對(duì)照組目的基因Ct值.對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值），相對(duì)含量變化=2-△△Ct。

病毒感染與加藥

使用6孔細(xì)胞板，分別將重組流感病毒（rgHl-PR8，rgH4 -PR8.rgH7-PR8）以MOI=O.01量與芒果苷0.8mg/ml使用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液1ml進(jìn)行混合，將混合液加入MDCK細(xì)胞中，37℃吸附1.5小時(shí)，吸去培養(yǎng)液。此時(shí)病毒感染的細(xì)胞分為兩組，其中一組加入不含芒果苷DMEM維持液2ml進(jìn)行維持，另一組使用含芒果苷0.8mg/ml的DMEM維持液2ml進(jìn)行維持。維持72小時(shí)后，使用real-time RT-PCR對(duì)病毒復(fù)制情況進(jìn)行定量分析。

統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x+s）表示;兩兩比較用t檢驗(yàn)，p<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

知母寧不同加藥方式的抗病毒作用

重組流感病毒rgHI-PR8，rgH4-PR8，rgH7-PR8均能在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。根據(jù)藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)得MDCK細(xì)胞對(duì)芒果苷半數(shù)中毒濃度為2.87mg/ml。本試驗(yàn)使用中濃度0.8mg/ml進(jìn)行流感病毒拷貝數(shù)變化觀察。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有三個(gè)不同HA亞型重組流感病毒在與細(xì)胞吸附過(guò)程中加入芒果苷后，使用不含芒果苷維持液進(jìn)行病毒培養(yǎng)（病毒+芒果苷+不含芒果苷維持液），與各自病毒對(duì)照組進(jìn)行比較，病毒拷貝數(shù)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而在使用含芒果苷的維持液培養(yǎng)后，病毒的拷貝數(shù)明顯低于單純病毒組。

四、討論

芒果苷至今仍未被開發(fā)為臨床藥物的原因之一是其藥理作用泛而弱，定位不突出。本研究圍繞流感病毒在細(xì)胞中的吸附和復(fù)制過(guò)程，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察了芒果苷的抗流感病毒的作用。

本研究顯示芒果苷對(duì)不同HA亞型流感病毒的吸附過(guò)程沒(méi)有特異性的抑制作用，但由于流感病毒的感染過(guò)程還包括膜融合、脫殼、核蛋白復(fù)合物入核、基因組的復(fù)制、組裝、出芽和釋放等步驟。因此，芒果苷作用的靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

本研究揭示芒果苷在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制過(guò)程中起到了抑制作用。除了以上提到的病毒自身復(fù)制的步驟可能會(huì)受到影響外，從宿主細(xì)胞層面，芒果苷能對(duì)細(xì)胞MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ERK、JNK、p38蛋白含量及磷酸化水平的產(chǎn)生影響。由于這些信號(hào)通路的活化能夠直接影響流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。因此芒果苷抗流感病毒的藥理機(jī)制也需要考慮其對(duì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可判斷芒果苷對(duì)不同HA亞型流感病毒的吸附過(guò)程沒(méi)有特異性的抑制作用，其作用靶點(diǎn)可能在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制過(guò)程。

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基金資助：貴州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（貴中醫(yī)大創(chuàng)合字（2019）-53號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：邱泰坤、安維婕、何紅玉、況凌楓、羅茂丹：在讀本科生。通訊作者：蔣立（1980-），男，土家族，貴州人，課題指導(dǎo)老師，副主任檢驗(yàn)技師，博士，研究方向：中醫(yī)藥抗病毒。