楊柳，熊吟，余永紅，胡顯鋒，石園園，江文凜，李艷蘭，杜艷華△

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，臨床80%～90%的腎臟惡性腫瘤都是腎細(xì)胞癌［1］。其發(fā)病占所有惡性腫瘤的2%～3%，在我國泌尿系腫瘤中僅次于膀胱腫瘤［2-3］。腎細(xì)胞癌起病隱匿，早期臨床表現(xiàn)不明顯。盡管診斷技術(shù)的改善提高了偶發(fā)性腎細(xì)胞癌的診斷率，依然有25%～30%的患者在確診時已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；而晚期轉(zhuǎn)移患者治療效果不夠理想，生活質(zhì)量較差［4］。深入探究腎癌發(fā)生進(jìn)展的機制，尋找臨床更有效的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)對腎癌的早期診斷和治療顯得尤為重要。

HJURP基因位于2號染色體，其與真菌蛋白Scm3結(jié)構(gòu)和功能相似且高度保守，作為分子伴侶與著絲粒蛋白A（CENPA）結(jié)合，介導(dǎo)CENPA與染色體著絲粒的結(jié)合，從而參與調(diào)節(jié)染色體的穩(wěn)定性［5-7］。目前在腫瘤研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HJURP在肝癌及肺癌中高表達(dá)，并且可以作為腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物［8-9］，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中敲低HJURP基因可影響細(xì)胞增殖能力且增強腫瘤放射敏感性［10］。但HJURP在人腎癌中的作用尚未見報道。本文通過檢測HJURP基因在惡性腎癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，并敲減腎癌細(xì)胞CAKI-1中HJURP基因，分析HJURP基因敲減后細(xì)胞增殖、周期及遷移的變化，旨在研究HJURP對腎癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)提取從TCGA數(shù)據(jù)庫下載腎癌測序基因數(shù)據(jù)（TCGA-KIRP），利用R軟件讀取原始文件后，使用Affy包中的RMA算法標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)后得到基因的表達(dá)矩陣，將預(yù)處理后得到的基因表達(dá)矩陣文件讀入R軟件，利用R軟件中l(wèi)imma包對腎癌組織樣本和癌旁組織樣本基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，并應(yīng)用貝葉斯檢驗方法進(jìn)行多重檢驗校正。差異基因判定標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)值倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）≥2或≤-2且P＜0.01。同時提取TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫腎癌患者生存預(yù)后信息，根據(jù)HJURP表達(dá)的中位數(shù)將患者分為HJURP低表達(dá)組及HJURP高表達(dá)組。

1.2 實驗材料組織標(biāo)本選自武漢市第四醫(yī)院2016年1月—2019年10月收治的20例腎癌患者腎癌組織與對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，其中男12例，女8例，年齡38～80歲，平均（52.30±7.24）歲。腎癌細(xì)胞株CAKI-1、786O、A498及正常化腎小管細(xì)胞HK2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自中國四季青公司。HJURP-靶特異性siRNA（si-HJURP）由吉凱基因合成。為避免脫靶效應(yīng)，實驗共設(shè)計3條si-HJURP序列：siRNA1，5′-ATCGAGCATCATCAGTATG-3′；siRNA2，5′-TAGCGCTGTATGAGACCAGTCAA-3′；siRNA3，5′-TACAGCACATGTCTGTGACAGAC-3′。空載體對照序列5′-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3′。HJURP一抗購自英國Abcam公司，鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、鈣黏附蛋白N（N-cadherin）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）及磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）一抗均購自美國CST公司。GAPDH內(nèi)參抗體購自美國Santa cruz公司。TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡（上海）科技有限公司，SYBR mix購自美國Bio-Rad公司。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，MTT試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，流式周期試劑盒和Transwell小室購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及實時熒光定量PCR（qPCR）檢測HJURP表達(dá)CAKI-1、786O、A498及正?；I小管細(xì)胞HK2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的4種細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用Primer Bank數(shù)據(jù)庫（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）查詢并設(shè)計相應(yīng)引物，HJURP引物上游5′-CCACGCTGACCTACGAGAC-3′，下游5′-CTCACCGCTTTTTGAATCGGC-3′，內(nèi)參GAPDH引物上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′。反應(yīng)體系：cDNA模板1μL，SYBR mix 10μL，上、下游引物（20μmol/L）各1μL，無RNA酶水7 μL。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，40個循環(huán)；72℃30 s，72℃10 min。目的mRNA的相對表達(dá)量用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行均一化，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 腎癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染實驗及siRNA敲減效率驗證取對數(shù)生長期的CAKI-1細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度融合度約60%時將細(xì)胞分為HJURP基因siRNA轉(zhuǎn)染組（si-HJURP組）及對照序列轉(zhuǎn)染組（NC組），分別進(jìn)行小干擾RNA及對照序列空載體siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h采用qPCR檢測HJURP表達(dá)水平，檢測方法同1.3。根據(jù)qPCR結(jié)果篩選出敲減效果最佳的siRNA用于后續(xù)實驗。

1.5 細(xì)胞克隆形成實驗取si-HJURP組及NC組CAKI-1細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以800個/孔接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育靜置培養(yǎng)2周。待細(xì)胞克隆形成，終止培養(yǎng)，使用4%多聚甲醛固定克隆細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫對細(xì)胞群落進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計細(xì)胞克隆形成數(shù)量。

1.6 MTT法檢測CAKI-1細(xì)胞增殖活性取si-HJURP組及NC組轉(zhuǎn)染的CAKI-1細(xì)胞，以3 000個/孔接種于96孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，每隔1 d在每個孔中加入20μL MTT在37℃孵育4 h棄培養(yǎng)液，各孔再加入DMSO 150μL，室溫振蕩10 min。通過酶標(biāo)儀測量490 nm處的光密度（OD）值，實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞周期檢測將si-HJURP組及NC組細(xì)胞消化離心后加入含有5%的PI和2%的RNaseA的PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，并用錫箔紙包裹離心管避光37℃孵育30 min，然后通過流式細(xì)胞儀檢測各實驗組細(xì)胞周期分布情況，實驗重復(fù)3次。

1.8 Transwell實驗檢測CAKI-1細(xì)胞侵襲能力消化轉(zhuǎn)染后的對數(shù)生長期細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，離心后用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞計數(shù)，然后在24孔板中加入600μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，取Transwell小室置于24孔板，在小室中加入200μL密度為3×105/mL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色。顯微鏡下采集圖像，計數(shù)遷移細(xì)胞，實驗重復(fù)3次。

1.9 Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及AKT通路蛋白表達(dá)水平變化取2組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后每孔40μg蛋白上樣，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法（恒流17 mA轉(zhuǎn)膜過夜）將蛋白轉(zhuǎn)移于PVDF膜上，次日切取含目的條帶的PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。孵育HJURP、E-cadherin、N-cadherin、AKT、p-AKT、GSK3β及p-GSK3β一抗與GAPDH內(nèi)參抗體（均為1∶10 000稀釋）于4℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，室溫孵育二抗（1∶10 000稀釋）2 h，再用TBST洗膜10 min×3次，ECL顯影、拍照后計算目的蛋白的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）比較。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較使用單因素方差分析，組間多重比較使用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HJURP在腎癌中的表達(dá)及其對生存預(yù)后的影響從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取533例腎癌患者基因測序數(shù)據(jù)的基因表達(dá)信息，經(jīng)生物信息學(xué)統(tǒng)計分析顯示HJURP在腎癌組織中明顯上調(diào)（t=12.623，P＜0.05），見圖1A。進(jìn)一步分析不同腫瘤分期HJURP的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著腎癌病理分期升高，HJURP表達(dá)量也增高（F=15.868，P＜0.05），見圖1B。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示HJURP高表達(dá)組患者總生存率和無病生存率較HJURP低表達(dá)組降低（P＜0.01）。見圖1C、D。

Fig.1 The expression of HJURP in renal cancer and its effect on prognosis analyzed by TCGA database圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析HJURP在腎癌中的表達(dá)及對預(yù)后的影響

2.2 腎癌組織及細(xì)胞中HJURP的表達(dá)水平qPCR結(jié)果顯示HJURP在腎癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（1.606±0.610vs.0.996±0.160；t=3.758，P＜0.01），見圖2A。同樣，腎癌細(xì)胞株A498、786O和CAKI-1中HJURP基因表達(dá)水平高于正?；I小管上 皮HK2細(xì) 胞株（F=14.484，P＜0.01），且 在CAKI-1細(xì)胞系中表達(dá)量最高（圖2B），因此后續(xù)細(xì)胞實驗采用CAKI-1細(xì)胞系。

Fig.2 The expressions of HJURP in renal cancer tissues and renal cancer cells圖2組織及細(xì)胞驗證HJURP在腎癌中的表達(dá)

2.3HJURP基因敲減后CAKI-1細(xì)胞活力及克隆形成受限qPCR結(jié)果顯示3個HJURP特異性siRNA序列轉(zhuǎn)染CAKI-1細(xì)胞后，HJURP表達(dá)水平顯著低于NC組（F=205.121，P＜0.01）。其中siRNA-1的敲減效果最佳，因此后續(xù)實驗采用siRNA-1進(jìn)行HJURP敲減。MTT實驗結(jié)果顯示，si-HJURP組轉(zhuǎn)染后第2天開始CAKI-1細(xì)胞活性顯著低于NC組。細(xì)胞克隆形成實驗也表明，與NC組相比，si-HJURP組CAKI-1細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低，細(xì)胞克隆形成集落顯著減少（個/視野：86.33±7.37vs.168.00±9.54，t=11.732，P＜0.01）。見圖3。

2.4HJURP基因影響CAKI-1細(xì)胞周期HJURP敲減后CAKI-1腎癌細(xì)胞的G2期細(xì)胞比例明顯升高［（20.48±6.24）%vs.（53.33±7.53）%，t=14.122，P＜0.01］；G1期的細(xì)胞比例下降［（58.67±3.25）%vs.（33.32±5.33）%，t=16.848，P＜0.01］；S期的細(xì)胞比例差異 無統(tǒng) 計學(xué) 意 義［（18.29±1.22）%vs.（16.33±2.01）%，t=1.819，P=0.143］，見圖4。

2.5HJURP影響CAKI-1腎癌細(xì)胞的體外遷移能力Transwell實驗結(jié)果顯示，si-HJURP組的細(xì)胞遷移數(shù)量顯著低于NC組［（103.0±3.5）個/視野vs.（152.3±8.7）個/視 野，t=4.714，P＜0.01］，見 圖5。Western blot結(jié)果顯示，HJURP敲減后CAKI-1細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白N-cadherin明顯下降，抑制腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白E-cadherin明顯上調(diào)，同時AKT通路關(guān)鍵蛋白p-AKT及p-GSK3β明顯下調(diào)，見圖6。

Fig.3 HJURP knockdown represses CAKI-1 viability and clone formation圖3 HJURP基因敲低降低CAKI-1細(xì)胞活力及克隆形成

3 討論

HJURP是近年來發(fā)現(xiàn)的一個原癌基因，在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。Chen等［11］發(fā)現(xiàn)HJURP在肝癌組織中高表達(dá)，且與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，同時通過體外細(xì)胞實驗證明HJURP通過MAPK/ERK1/2及AKT/GSK3β信號通路破壞抑癌基因P21蛋白的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)，HJURP作為原癌基因促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，敲除HJURP基因后，腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，增殖減緩，進(jìn)一步的機制研究顯示HJURP可能通過PPARγ-SIRT1通路影響腫瘤的代謝［12］。此外另一項研究顯示HJURP在人乳腺癌細(xì)胞系和原發(fā)性乳腺癌中高表達(dá)，HJURP的表達(dá)水平影響乳腺癌患者的預(yù)后且與其放射治療結(jié)果相關(guān)，HJURP水平高的患者對放療更為敏感；體外實驗同樣表明，高表達(dá)HJURP的細(xì)胞對放射治療更為敏感，并且其凋亡率更高［13］。然而HJURP在腎癌的發(fā)生發(fā)展中的作用機制目前尚不清楚。

Fig.4 Flow cytometry results of HJURP knockdown in two groups圖4 si-HJURP組和NC組細(xì)胞周期分布流式圖

Fig.5 Changes of cell migration ability in si-HJURP group and NC group(×200)圖5 si-HJURP組和NC組細(xì)胞遷移能力變化（×200）

Fig.6 The key protein changes of EMT and AKT pathway after HJURP knockdown圖6 HJURP敲減后EMT及AKT通路蛋白表達(dá)變化

本研究利用TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)HJURP在腎癌中顯著高表達(dá)，生存及預(yù)后分析結(jié)果顯示，HJURP高表達(dá)組患者較低表達(dá)組預(yù)后明顯較差。進(jìn)一步的臨床腎癌組織標(biāo)本結(jié)果同樣證實，HJURP在腎癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示HJURP可能作為原癌基因參與腎癌腫瘤的形成及進(jìn)展。

為進(jìn)一步確定HJURP是否作為功能性的原癌基因參與腎癌進(jìn)展，筆者檢測了HJURP過表達(dá)對腎癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。HJURPsiRNA轉(zhuǎn)染CAKI-1細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)沉默HJURP表達(dá)后腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲和克隆能力明顯下降。細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，細(xì)胞周期的異常調(diào)節(jié)對腫瘤發(fā)生機制具有重要意義［14］。本研究中，沉默HJURP后引起腎癌細(xì)胞G2期阻滯，表明HJURP表達(dá)下調(diào)后可將腎癌細(xì)胞阻滯在G2期，從而抑制其在體內(nèi)外的增殖能力。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示si-HJURP組促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白N-cadherin明顯下降，抑制腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白E-cadherin明顯增加，蛋白水平驗證了HJURP的表達(dá)水平確與腎癌細(xì)胞的遷移能力相關(guān)，提示HJURP可能通過EMT途徑促進(jìn)腎癌細(xì)胞的侵襲遷移。AKT是在腫瘤細(xì)胞代謝、凋亡及細(xì)胞遷移等多種過程中起到重要作用的一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶［15-16］，AKT過度激活可促進(jìn)各種腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。本實驗通路蛋白檢測結(jié)果顯示，HJURP基因下調(diào)后AKT通路關(guān)鍵功能蛋白p-AKT及p-GSK3β明顯下調(diào)，說明HJURP可能通過AKT通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞的侵襲遷移。

綜上所述，腎癌組織中HJURP的表達(dá)水平較癌旁正常組織升高，敲減HJURP表達(dá)可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，其可作為腎癌的潛在臨床診治靶點及預(yù)后標(biāo)志物。