羅影，左中夫，張俏，薛坤，劉暢，閔連秋

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）多發(fā)于兒童和青少年，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，隨著病程的延長，多引起糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）［1］。DN為T1DM患者死亡的主要原因。T1DM患者發(fā)生DN多與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，但僅僅針對以上因素并不能完全阻止DN的發(fā)生。氧化應(yīng)激可使糖尿病患者機(jī)體代謝紊亂［2］，從而引起活性氧異常增加，為DN發(fā)病的重要原因［3］。通過抑制T1DM小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)可明顯減輕其引起的DN損傷［4］。蜂膠乙醇提取物（ethanol extract of Chinese propolis，EECP）富含黃酮類物質(zhì)，是一種天然的抗氧化劑［5］。研究發(fā)現(xiàn)，EECP能降低血糖并發(fā)揮抗氧化功能［6］。EECP可直接調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖，同時也可降低丙二醛（MDA），提高超氧化物歧化酶（SOD），對抗視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷［7］。然而，EECP對T1DM大鼠腎臟的影響及作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過鏈脲佐菌素（STZ）制備T1DM模型，對大鼠進(jìn)行灌胃治療，進(jìn)而探討EECP對T1DM大鼠腎臟的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物和主要試劑儀器SPF級雄性SD大鼠68只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)，編號：SCXK（遼）2009-2017。STZ購自美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍（施貴寶制藥公司，規(guī)格0.5 g/片）；EECP（西安西海生物科技公司，純度98%）；NADPH氧化酶4（NOX4）一抗（兔抗鼠）、pp38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）一抗（兔抗鼠）、p38 MAPK一抗（兔抗鼠）購自英國Abcam公司；MDA、SOD含量檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；HE染色試劑盒及Western blot山羊抗兔二抗購自北京碧云天公司。倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；石蠟切片機(jī)（德國SLEE公司）；水平電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗動物分組及模型制備大鼠采用單次腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的STZ（55 mg/kg）誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型，72 h后檢測大鼠尾靜脈空腹血糖，＞16.7 mmol/L作為糖尿病模型［8］。其中，模型制備成功50只，失敗8只，成模率為86.2%。將成功的糖尿病大鼠模型采用隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、EECP 50 mg/kg組、EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組及二甲雙胍組，每組10只。另外10只大鼠作為正常組。動物成模1周后給藥灌胃，每日1次。依據(jù)文獻(xiàn)［7］，EECP 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg組給予相應(yīng)劑量EECP灌胃治療，二甲雙胍組給予二甲雙胍75 mg/kg灌胃，藥物溶劑為雙蒸水，正常組和模型組給予等劑量雙蒸水，給藥體積為10 mL/g。實(shí)驗期間監(jiān)測大鼠血糖變化。未見大鼠死亡，實(shí)驗遵循國家《實(shí)驗動物管理條例》。12周后，處死大鼠用于各項指標(biāo)檢測。

1.2.2 標(biāo)本采集12周治療結(jié)束后，在同一時間點(diǎn)檢測大鼠尾靜脈空腹血糖，大鼠處死前麻醉固定，于心尖搏動最強(qiáng)處進(jìn)針，利用心臟跳動血液進(jìn)入注射器，每只大鼠取心臟血1 mL，離心取上清-20℃凍存，待測血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。12周后，每組隨機(jī)取5只大鼠，打開大鼠腹腔，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟固定自身組織，固定完成后取出腎臟進(jìn)行石蠟包埋、切片。剩余5只大鼠處死后取完整腎臟做冠狀切面，其中1/2依據(jù)質(zhì)量加蛋白裂解液，冰上剪碎，4℃離心25 min后取上清，-20℃保存用于Western blot；另1/2與生理鹽水按1∶4制成勻漿，3 000 r/min離心5 min，上清用于腎組織MDA含量、SOD活性檢測。

1.2.3 血Scr和BUN及 腎 組 織MDA含 量、SOD活 性 的 檢測Scr和BUN采用全自動生化分析儀檢測，MDA含量、SOD活性采用相應(yīng)試劑盒，具體步驟按照說明書執(zhí)行。

1.2.4 HE染色經(jīng)1.2.2制備的大鼠腎臟切片脫蠟后PBS洗3次；蘇木素浸染，2 min，自來水沖洗；伊紅浸染1 min，自來水沖洗；脫水透明后封片，倒置顯微鏡拍照觀察大鼠腎臟病理改變。

1.2.5 免疫組化檢測大鼠腎臟NOX4表達(dá)經(jīng)1.2.2制備的大鼠腎臟石蠟切片脫蠟后于PBS洗3次；3%H2O2室溫12 min，PBS洗3次，每次3 min；3%山羊血清室溫孵育30 min；滴加兔抗大鼠NOX4（1∶800），4℃過夜；PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗（1∶500），室溫30 min；PBS洗3次，每次3 min；滴加SABC試劑，室溫30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明封片后顯微鏡拍照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色為陽性染色，每張切片在顯微鏡下取5個高倍視野，各計數(shù)200個細(xì)胞，計算平均陽性細(xì)胞百分比為NOX4表達(dá)陽性率。

1.2.6 Western blot檢測大鼠腎臟NOX4、p-p38 MAPK及p38 MAPK相對表達(dá)量BCA法測定蛋白含量，電泳時加入15 μL樣品；120 V電壓電泳，轉(zhuǎn)膜后1%BSA封閉2 h；加入一抗NOX4（1∶10 000）、p-p38 MAPK（1∶5 000）、p38 MAPK（1∶5 000），4℃孵育過夜；TBST洗4次，每次5 min；加入二抗室溫孵育2 h；TBST洗4次，每次5 min；ECL顯影，以β-tublin為對照，image J軟件分析灰度值，蛋白相對表達(dá)=蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EECP對大鼠血糖的影響與正常組比較，模型組建模后血糖明顯升高（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組血糖明顯降低（P＜0.05）；與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組血糖明顯降低（P＜0.05）；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組建模后血糖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Comparison of blood glucose before and after modeling in 6 groups of rats表1 6組大鼠建模前后血糖的比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of blood glucose before and after modeling in 6 groups of rats表1 6組大鼠建模前后血糖的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與正常組比較，b與模型組比較，c與EECP 50 mg/kg組比較，d與EECP 100 mg/kg組比較，e與EECP 200 mg/kg組比較，P＜0.05；表2～4同

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg組EECP 100 mg/kg組EECP 200 mg/kg組二甲雙胍組F建模前血糖（mmol/L）6.29±0.20 6.32±0.18 6.23±0.18 6.26±0.25 6.29±0.17 6.24±0.14 0.327建模治療后血糖（mmol/L）6.25±0.14 21.41±1.54a 19.10±1.16ab 15.36±0.57abc 15.55±0.47abc 6.46±0.36bcde 547.166＊＊

2.2 EECP對大鼠Scr與BUN含量的影響與正常組比較，模型組Scr、BUN明顯升高（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組Scr、BUN明顯降低（P＜0.05），與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組Scr、BUN明顯降低；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組Scr、BUN比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of Scr and BUN contents between 6 groups of rats表2 6組大鼠Scr與BUN含量的比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of Scr and BUN contents between 6 groups of rats表2 6組大鼠Scr與BUN含量的比較（n=10，±s）

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg EECP 100 mg/kg EECP 200 mg/kg二甲雙胍組F Scr（μmol/L）28.16±0.65 48.29±0.96a 43.26±1.02ab 38.21±1.11abc 38.14±0.67abc 28.20±0.48bcde 903.437＊＊BUN（mmol/L）6.61±0.15 17.38±0.51a 16.57±0.47ab 13.40±0.48abc 13.60±0.28abc 6.67±0.17bcde 1584.983＊＊

2.3 EECP對大鼠腎組織氧化應(yīng)激的影響與正常組比較，模型組MDA升高、SOD降低（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組MDA降低、SOD升高（P＜0.05）；與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組MDA降低、SOD升高（P＜0.05）；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組MDA、SOD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Comparison of oxidative stress indexes between 6 groups of rats表3 6組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of oxidative stress indexes between 6 groups of rats表3 6組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較（n=10，±s）

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg組EECP 100 mg/kg組EECP 200 mg/kg組二甲雙胍組F MDA（μmol/L）5.62±0.15 13.80±0.35a 10.78±0.25ab 6.16±0.11abc 6.22±0.15abc 5.68±0.13bcde 1 355.355＊＊SOD（U/L）110.90±1.04 65.70±0.58a 68.14±0.92ab 78.80±0.61abc 78.38±0.73abc 110.22±1.36bcde 2 438.524＊＊

2.4 EECP對大鼠腎臟病理學(xué)的影響與正常組比較，模型組腎小球體積增大，細(xì)胞外基質(zhì)增生，并可見腎小管上皮細(xì)胞水腫；與模型組相比，EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組及二甲雙胍組腎小球體積明顯減小，水腫明顯減輕，見圖1。

Fig.1 Effects of EECP on renal tissue structure of rats(HE staining,×400)圖1 EECP對大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響（HE染色，×400）

2.5 EECP對大鼠腎 組 織NOX4、p-p38 MAPK及p38 MAPK蛋白相對表達(dá)的影響各組之間p38 MAPK表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組NOX4陽性率、NOX4蛋白相對表達(dá)量、p-p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與EECP 50 mg/kg組比較、EECP 100 mg/kg組、EECP 200 mg/kg組、二甲雙胍組NOX4陽性率、NOX4蛋白相對表達(dá)量、p-p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與EECP 100 mg/kg組和EECP 200 mg/kg組比較，二甲雙胍組NOX4陽性率、NOX4蛋白相對表達(dá)量、p-p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；EECP 100 mg/kg組與EECP 200 mg/kg組、正常組與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2、3，表4。

Fig.2 Effects of EECP on the expression of NOX4 in rat kidney(immunohistochemistry,×400)圖2 EECP對大鼠腎臟組織NOX4表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×400）

Fig.3 Western blot analysis the protein expressions of NOX4 and pp38 MAPK in rat kidney圖3 Western blot檢測大鼠腎組織NOX4及p-p38 MAPK蛋白相對表達(dá)

Tab.4 Comparison of the expressions of NOX4 and pp38 MAPK in the kidney tissues between 6 groups of rats表4 6組大鼠腎組織NOX4及p-p38 MAPK表達(dá)的比較（n=5，%，±s）

Tab.4 Comparison of the expressions of NOX4 and pp38 MAPK in the kidney tissues between 6 groups of rats表4 6組大鼠腎組織NOX4及p-p38 MAPK表達(dá)的比較（n=5，%，±s）

組別正常組模型組EECP 50 mg/kg組100 mg/kg組200 mg/kg組二甲雙胍組F NOX4陽性率9.34±0.11 32.48±0.38a NOX4蛋白10.78±0.08 35.62±0.50a p38 MAPK蛋白38.34±0.67 38.56±0.32 p-p38 MAPK蛋白6.26±0.17 32.58±0.61a 28.40±0.42a 15.44±0.43abc 15.22±0.62abc 9.22±0.08bcde 3 180.667＊＊31.58±0.63a 17.34±0.41abc 17.32±0.56abc 10.58±0.13bcde 2 936.802＊＊38.08±0.71 38.38±0.26 38.30±0.59 38.34±0.61 0.387 28.30±0.45a 15.78±0.51abc 16.16±0.54abc 6.30±0.19bcde 3 053.664＊＊

3 討論

DN是世界范圍內(nèi)慢性腎損傷的主要病因之一，為血管性疾病的高危因素。DN的功能特點(diǎn)是腎小球濾過功能障礙和腎小球肥大。尿白蛋白排泄增加、Scr水平升高是評估DN患者腎功能的重要指標(biāo)［9］。STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型已廣泛應(yīng)用于其相關(guān)并發(fā)癥的研究［10］。本研究成功地建立了DN大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組血Scr和BUN水平明顯增加，腎小球體積增大，細(xì)胞外基質(zhì)增生等病理改變，與以往關(guān)于DN的文獻(xiàn)［11］報道相符。蜂膠具有多種藥理作用，包括抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗炎等。EECP為蜂膠的提取物，其含有大量的酚醛和多酚化合物，因此具有較強(qiáng)的抗氧化活性［5］。EECP可直接調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖，同時也可降低MDA含量、提高SOD活性進(jìn)而對抗視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷［7］。在本實(shí)驗中，EECP100 mg/kg、200 mg/kg組及二甲雙胍組可明顯降低T1DM大鼠血糖、Scr和BUN水平，同時HE染色顯示大鼠腎組織損傷程度明顯減輕，驗證了EECP對T1DM大鼠的治療作用。然而，EECP100 mg/kg和200 mg/kg治療效果之間差異并不明顯，說明提高藥物的劑量并不能增加其治療效果。

慢性高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在DN的進(jìn)程中有重要作用。氧化應(yīng)激的程度主要取決于活性氧的生成，特別是O2-和H2O2的生成，以及SOD和MDA在內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡［12］。文獻(xiàn)報道，DN患者內(nèi)源性抗氧化分子（包括SOD和谷胱甘肽過氧化物酶）明顯減少，而MDA含量明顯增加，最終引起活性氧增加，加速腎損傷進(jìn)程［13］。腎臟容易受到氧化應(yīng)激影響，活性氧水平的升高可直接造成腎臟損傷。Sameni等［14］研究發(fā)現(xiàn)，EECP可明顯降低糖尿病大鼠體質(zhì)量、血糖水平、腎小球基底膜厚度和腎小球面積，同時還可顯著降低MDA含量，提高SOD，從而提高總抗氧化能力，這與本研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，對DN大鼠給予EECP 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg灌胃治療后，顯示出了明顯的抗氧化作用，MDA含量明顯下降，SOD活性明顯增加，這提示EECP可能通過抗氧化應(yīng)激對DN大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，但具體機(jī)制不清。

NOX4為腎細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的重要分子，通過催化電子從NAPDH轉(zhuǎn)移到分子氧而產(chǎn)生超氧陰離子［15］。NOX4引起的活性氧升高被認(rèn)為能夠促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的積累［16］。在STZ誘導(dǎo)的DN中，NOX4定位于腎皮質(zhì)細(xì)胞的膜和線粒體，并大量表達(dá)［17］。此外，NOX4近來被認(rèn)為能夠加速DN動物模型腎損傷的進(jìn)程，是糖尿病早期腎臟活性氧的主要來源，在足細(xì)胞中由于高血糖誘導(dǎo)而上調(diào)，下調(diào)NOX4對DN小鼠模型具有腎臟保護(hù)作用［18］。此外，NOX4抑制劑GKT137831可通過抑制腎小球肥大、減少尿白蛋白排泄和足細(xì)胞丟失而緩解DN的腎臟損傷［19］。有文獻(xiàn)報道，MAPK家族中p38 MAPK表達(dá)的變化對氧化應(yīng)激損傷尤為重要［20］。本研究進(jìn)一步證實(shí)，DN狀態(tài)下大鼠腎臟pp38 MAPK和NOX4表達(dá)明顯上調(diào)，而給予EECP治療后，可明顯促進(jìn)p-p38 MAPK和NOX4表達(dá)下調(diào)。在p-p38 MAPK和NOX4表達(dá)下調(diào)的同時，MDA含量明顯下降，SOD活性明顯增加，這提示EECP在一定程度上可以抑制p-p38 MAPK和NOX4的表達(dá)，進(jìn)而通過抗氧化作用保護(hù)DN大鼠的腎臟。

綜上所述，EECP可通過降低T1DM大鼠血糖、Scr和BUN水平，增強(qiáng)大鼠抗氧化能力進(jìn)而緩解T1DM大鼠腎臟損傷，其機(jī)制可能與降低血糖和抑制p38 MAPK/NOX4信號通路有關(guān)。EECP治療效果雖沒有達(dá)到正常組標(biāo)準(zhǔn)，與二甲雙胍治療效果尚有差距，但為新藥開發(fā)提供了更多的思路。