孔營楠 ，詹松華，龔志剛，楊爍慧，陸 方，莊麗華，劉孟瀟

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院放射科，上海 201203；2.西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司上海分部，上海 200120）

近年來，我國腦血管疾病的發(fā)病率呈上升趨勢［1］。腦卒中根據(jù)病因分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中2 種，前者約占70%［2］。缺血性腦卒中在中老年患者中呈高發(fā)狀態(tài)，其致殘率、致死率較高，且發(fā)病年齡越來越年輕化，不僅給社會、家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔，而且影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。本研究通過炎癥反應結(jié)合現(xiàn)代MRI 分子影像技術(shù)觀察電針減輕小鼠腦缺血再灌注損傷的炎性反應信號機制，以幫助臨床有效治療缺血性腦卒中，并為今后的研究提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選擇野生型健康成年C57BL/6n 小鼠30 只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，SPF 級，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，環(huán)境設施動物許可證號：SYXK（滬）2014-0008。實驗動物中心無菌飼養(yǎng)，實驗室溫度22 ℃，空氣濕度75%。所有實驗和程序均通過上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（倫理登記號：SZY201712006）。

1.2 儀器與方法

1.2.1 造模及分組 30 只小鼠隨機分為假手術(shù)組、大腦中動脈栓塞缺血再灌注組（MCAO 缺血再灌注組）、電針組各10 只。沿用傳統(tǒng)改良Longa 式栓線法制備小鼠右側(cè)MCAO 缺血再灌注損傷模型［1］。術(shù)前禁食24 h，于腹腔注射4%水合氯醛，劑量35 mg/kg體質(zhì)量。待麻醉后，在頸部正中間偏右少許縱行切開皮膚，長度約1 cm。按解剖順序輕柔鈍性分離肌肉及筋膜，見右側(cè)頸外動脈及頸動脈鞘后，將鞘內(nèi)頸總動脈、迷走神經(jīng)及頸內(nèi)動脈依次分開，夾閉頸外動脈一端使其處于游離狀態(tài)。將2 根縫線放置于右側(cè)頸總動脈，1 根在靠近分叉1 cm 處結(jié)扎，另外1 根備用。將預先準備好的線栓放入對應型號醫(yī)用針頭中，頭端以不露出為準，將針頭從頸總動脈結(jié)扎處前端刺入，用鑷子輕輕推動線栓尾部，不斷調(diào)整位置使其順利進入頸內(nèi)動脈，再用鑷子夾住針頭前方血管及線栓頂部，迅速退出針頭。右手將線栓繼續(xù)推入頸內(nèi)動脈，待感覺到對抗力時，再輕微向前推動少許，此時線栓頂部已處于大腦中動脈起始處，血流阻止，插線停止前進。插線成功后結(jié)扎頸總動脈固定線栓，滴2～3 滴青霉素粉劑稀釋液，分層逐步縫合手術(shù)切口，清潔步驟完成后放入籠中，單個保溫喂養(yǎng)。缺血30 min 后，插入線栓使用血管鉗緩慢往外拉出，待退至頸內(nèi)外動脈分叉處時，剪斷線栓，實現(xiàn)血流再灌注。假手術(shù)組造模時僅分離頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，即刻縫合切口。

1.2.2 電針干預 電針組小鼠在清醒后2 h 取患側(cè)足三里穴及百會穴透刺患側(cè)太陽穴行電針治療，針刺穴位的定位標準按照《實驗針灸學》［4］制訂的實驗動物穴位圖譜；連接電針治療儀，疏密波輪換刺激：疏波4 Hz，密波20 Hz，0.5 mA，輸出電壓強度1～3 V，電針時間30 min，以相應干預刺激腧穴出現(xiàn)輕度顫動為度。假手術(shù)組及MCAO 缺血再灌注組均不予電針治療，每日與電針組同時固定捆綁刺激，以排除小鼠應激反應出現(xiàn)的結(jié)果誤差。

1.3 取材及處理 再灌注48 h 后小鼠神經(jīng)功能活動情況選擇Longa 5 分法評分標準評價［5］；造模成功后所有小鼠均行尾靜脈超微超順磁氧化鐵顆粒（USPIO）注射，MRI 掃描橫軸位和冠狀位T1WI、T2WI及SWI 結(jié)束后取血、取腦。圖像上傳至后處理工作站，測量T2WI 及SWI 冠狀位梗死側(cè)與正常側(cè)信號值比值。室溫下，先眼眶取血，待全血靜置30 min 后離心，取上層血清，行相關(guān)炎癥信號指標（IL-1β、TNF-α）酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測。將腦組織浸入4%多聚甲醛溶液中，后在分級系列的乙醇中脫水并包埋于石蠟中。石蠟切片，腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞情況采取病理HE 染色觀察；免疫組化染色觀察腦組織梗死區(qū)域鐵粒子的吞噬情況；實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）法測量腦組織梗死區(qū)域TLR4 的mRNA 表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示；采用單因素方差分析及秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U 檢驗法），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組MRI 信號與HE 染色、免疫組化染色對照假手術(shù)組（圖1a～1e）于再灌注后48 h 行MRI 掃描，MRI 圖像未見異常信號，對應右側(cè)腦組織細胞形態(tài)正常，無明顯病理改變，相應免疫組化中有極少活化小膠質(zhì)細胞且無鐵染色顆粒。MCAO 缺血再灌注組（圖2a～2e）、電針組（圖3a～3e）于再灌注后48 h 行MRI 掃描，T1WI、T2WI 及SWI 均可見分布不均的斑片狀及斑點狀異常信號，部分沿大腦邊緣位置走行；相對MCAO 缺血再灌注組，電針組T2WI 信號值比值明顯降低（P＜0.05），SWI 信號值比值明顯升高（P＜0.05）（表1）；對應右側(cè)腦組織病理結(jié)構(gòu)變化明顯，活化小膠質(zhì)細胞增加，數(shù)量豐富，可見藍色鐵顆粒散在顯示，部分顯示陽性小膠質(zhì)細胞吞噬鐵顆粒，以上電針組均較MCAO 缺血再灌注組減少。

2.2 3 組小鼠再灌注后48 h 血清炎性因子IL-1β、TNF-α 表達水平比較（圖4） IL-1β、TNF-α 數(shù)值假手術(shù)組分別為（4.657±0.921）、（4.900±1.202）pg/mL，MCAO 缺血再灌注組分別為（23.022±6.114）、（16.703±2.886）pg/mL，電針組分別為（14.975±6.209）、（10.618±1.248）pg/mL，MCAO 缺血再灌注組與其他2 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

2.3 3 組小鼠再灌注后48 h 腦組織梗死區(qū)域TLR4 mRNA 相對表達量比較（圖5） TLR4 mRNA 相對表達量假手術(shù)組為10，MCAO 缺血再灌注組為1.817±0.308，電針組為1.254±0.097，MCAO 缺血再灌注組與其他2 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

表1 2 組小鼠再灌注后48 h 的T2WI、SWI 冠狀位最低信號值比值比較（）

表1 2 組小鼠再灌注后48 h 的T2WI、SWI 冠狀位最低信號值比值比較（）

注：MCAO，大腦中動脈栓塞；與MCAO 缺血再灌注組比較，#P＜0.05。2 組各10 只小鼠，均僅9 只成功完成掃描，18 只中剔除呼吸偽影較重4 只、右側(cè)大腦中動脈梗死但無小膠質(zhì)細胞吞噬USPIO 的8 只，實際進行MRI 信號值分析的僅6 只，每組各3只。

3 討論

3.1 電針后各組T2WI 信號值變化結(jié)合免疫組化、HE 染色結(jié)果 MCAO 缺血再灌注組右側(cè)大腦半球中動脈供血區(qū)可見T2WI 高亮度區(qū)域信號值部分散在缺失，T1WI 呈高信號，免疫組化上有散在藍色鐵顆粒顯示，分析可能是缺血再灌注小鼠成模后，炎性反應加重，梗死區(qū)低信號處有更多活化的小膠質(zhì)細胞和持續(xù)外源性吞噬細胞的聚集進入，吞噬USPIO 所致。而本研究選用的MRI 對比劑是一種超微超順磁氧化鐵顆粒，既能下降T2WI 信號，又可升高T1WI 信號值。MCAO 缺血再灌注組梗死區(qū)域T2WI 最低信號強度比值在電針刺激右側(cè)足三里穴及百會穴透刺太陽穴后顯著升高，其機制可能是由于電針刺激抑制了病灶區(qū)小膠質(zhì)細胞的活化，導致其吞噬USPIO 的數(shù)量明顯減少，說明電針治療后炎癥信號下降，水腫減輕，炎性反應降低，腦神經(jīng)功能改善；相較于MCAO缺血再灌注組，電針組SWI 最低信號比值升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），原因可能是各組樣本量小，統(tǒng)計數(shù)據(jù)受個體差異的影響，誤差增大，以及USPIO 在SWI 序列中的放大作用。

3.2 電針對腦缺血再灌注損傷小鼠TLR4 信號通路相關(guān)炎性細胞因子的調(diào)節(jié)作用 腦缺血再灌注后的炎癥損傷早期主要由促炎指標TNF-α 引起，這種細胞因子被巨噬細胞合成，尤其是活化的小膠質(zhì)細胞是其最重要的來源之一［5］。此過程的炎癥效應和免疫應答均由TNF-α 誘導［6-7］，一系列局部腦組織損傷加重效應形成：激活中性粒細胞和淋巴細胞，促進黏附分子及IL-1β、IL-6 等其他炎癥介質(zhì)的合成［8］，進而加劇過氧化損傷，神經(jīng)細胞終末歸宿為變性壞死［9］。本實驗各組小鼠于灌注后48 h 其IL-1β 表達趨勢與TNF-α 基本一致，均在MCAO 缺血再灌注組表達量最多，說明小鼠在缺血再灌注后腦組織損傷加劇。電針組兩者表達量均較模型組明顯下降，且IL-1β 降低更明顯，說明電針干預后可明顯減少TNF-α、IL-1β的過量分泌，且IL-1β 更敏感。

3.3 電針對腦缺血再灌注損傷小鼠TLR4 信號通路TLR4 mRNA 的調(diào)節(jié)作用 Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類保守模式識別受體家族，可識別所謂的損傷相關(guān)分子模式內(nèi)源性配體，并介導宿主對損傷和應激的炎性反應［10］。TLRS與同源配體的綁定通過信號通路引起細胞的活化，包括銜接體的招募，其下游產(chǎn)物包括骨髓分化因子88、TIR 結(jié)構(gòu)域-銜接蛋白-誘導干擾素、TIR 結(jié)構(gòu)域-銜接蛋白和TRIF 相關(guān)銜接分子及MyD88-和/或TRIF 依賴通路中炎性介質(zhì)和I 型干擾素的相關(guān)產(chǎn)物［11-12］。其中部分TLRs（TLR2、TLR4 和TLR6）的活化間接產(chǎn)生MyD88，后啟動一系列信號的連結(jié)反應，導致轉(zhuǎn)錄因子-κB、干擾素調(diào)節(jié)因子等的激活，接著促炎細胞因子、黏附因子、Ⅰ型干擾素和協(xié)同刺激分子及趨化因子表達。TLR4 是由腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞表達的主要TLRs 蛋白，TLR4 信號通路成為小膠質(zhì)細胞活化和調(diào)節(jié)其功能的重要開關(guān)［13］。因此，機體在缺血再灌注損傷發(fā)生后，電針干預可調(diào)節(jié)自身TLR4 mRNA 的表達，使其含量下降，從而降低其自身炎癥反應，實現(xiàn)保護腦功能作用。這一結(jié)果與吳明娟［14］的研究結(jié)果基本一致，其研究表明TLR4 表達含量在腦缺血再灌注后呈升高趨勢，說明TLR4 mRNA 的表達可被腦缺血炎癥損傷激活，電針刺激可能通過降低TLR4 mRNA 含量，進而降低其引導的炎癥因子分泌來減輕腦缺血再灌注炎癥損傷級聯(lián)反應。

綜上所述，采用Longa 式線栓改良法成功建立小鼠MCAO 栓塞缺血再灌注損傷模型并觀察到神經(jīng)功能缺損癥狀，梗死面積穩(wěn)定可靠。電針能夠改善小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀、減少活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量、升高冠狀位T2WI 負性強化信號，縮小腦梗死面積；可能機制為下調(diào)了TLR4 信號通路中TLR4 mRNA 及信號相關(guān)下游促炎細胞因子IL-1β、TNF-α 的表達。