郭曉雨 宋曉飛 李曉麗 孫成振 閆立英

摘? ? 要：黃瓜為重要的蔬菜作物，解析黃瓜果瘤位置性狀遺傳規(guī)律與QTL定位，對深入研究果瘤位置形成分子機制和新品種選育有重要意義。以果瘤上移自交系X1（P1）和果瘤下移自交系X2（P2）為親本構(gòu)建F2群體，進行表型鑒定，解析遺傳規(guī)律。分別選取20株果瘤上移和20株果瘤下移極端表型植株，構(gòu)建果瘤上移池（Tu）、果瘤下移池（Td）和親本池（Mp、Pp）并進行高通量測序（BSA-seq）。結(jié)合生物信息學分析，預測與黃瓜瓜把果瘤位置相關(guān)的QTL。根據(jù)黃瓜果瘤位置表型數(shù)據(jù)分析，P1平均值均為負值，為果瘤上移，P2平均值均為正值，為果瘤下移;F1傾向于母本，F(xiàn)1反傾向于父本，F(xiàn)2在5.22～6.14間為高親值（接近父本），在0.23～2.32間為低親值（接近母本），黃瓜果瘤位置表現(xiàn)為數(shù)量性狀，F(xiàn)2更趨向于果瘤下移。預測到的候選基因主要與細胞的新陳代謝（CsaV3_1G009410、CsaV3_1G012820、CsaV3_1G028340）、信號轉(zhuǎn)導（CsaV3_1G012480、CsaV3_4G029960、CsaV3_1G030640、CsaV3_1G029520、CsaV3_1G004360）、結(jié)構(gòu)蛋白（CsaV3_1G030620、CsaV3_5G004870、CsaV3_1G031140），以及細胞激酶（CsaV3_1G033300、CsaV3_4G034190）和植物激素（CsaV3_5G015510）有關(guān)。根據(jù)△All-index在染色體上的分布推斷位于1號染色體（5.840～18.376 Mbp）的CsaV3_1G030610、CsaV3_1G029520和CsaV3_1G030640為主要候選基因。CsaV3_1G030610中的阿魏酸與細胞壁形成有關(guān);CsaV3_1G029520中的擬南芥SMAX1家族基因，作為KAR/SL信號分子調(diào)控種子萌發(fā)、根毛的形成與伸長;CsaV3_1G030640編碼與ARIA相互作用的ap2結(jié)構(gòu)域蛋白ADAP，正調(diào)控ABA信號，進而影響生長發(fā)育。因此推測果瘤位置的形成與細胞壁相關(guān)基因及信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。推測定位于黃瓜1號染色體重疊區(qū)域（5.840～18.376 Mbp）的候選基因CsaV3_1G030610主要參與細胞壁形成，與果瘤有關(guān)聯(lián)，推測其與黃瓜果瘤位置性狀有關(guān)系，但還需進一步研究。

關(guān)鍵詞：黃瓜;果瘤位置;BSA-seq;QTL定位

中圖分類號：S642.2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2020）09-012-06

Abstract： Cucumber is an important vegetable. The analysis of the genetic rules and QTL mapping of cucumber tuberculate fruit position is of great significance to deeply study the molecular mechanism of the formation of tuberculate fruit position and breed new varieties. The F2 population was constructed with the X1 （P1） inbred upward inbred line and X2 （P2） inferior inbred downward line to carry out the phenotypic identification and analyze the genetic rules. Select twenty sarcoma upshift and 20 sarcoma downshift extreme phenotypic plants respectively to construct sarcoma upshift pool （Tu）， sarcoma downshift pool （Td） and parent pool （Mp， Pp） for high pass quantitative sequencing （BSA-seq）. Combined with bioinformatics analysis， it predicts QTL related to the location of cucumber gourd. According to the phenotypic data analysis of the position of cucumber tuberculate fruit， .the tuberculate fruit position shows a quantitative trait， and F2 more tends to tuberculate fruit is low down. It is speculated that the formation of the tuberculate fruit position is related to cell wall related genes and signal transduction. This study predicts that the candidate genes CsaV3_1G030610 is mainly involved in cell wall formation and is related to tuberculate fruit， which is located in the overlapping region of cucumber chromosome 1 （5.840-18.376 Mbp）. It is speculated that they are related to tuberculate fruit position and need to further research.

Key words： Cucumber; Tuberculate fruit position; BSA-seq; QTL

黃瓜（Cucumis sativus L.）屬葫蘆科蔬菜作物，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。黃瓜瓜把上的果瘤位置是重要的外觀品質(zhì)性狀，消費者更傾向于購買果瘤偏上的黃瓜。研究黃瓜果瘤位置的遺傳規(guī)律及QTL定位，不僅有利于解析黃瓜果瘤位置形成的分子機制，而且有利于推動黃瓜品質(zhì)育種的進程。王桂玲等[1]研究表明，果瘤是由Tu（Tuberculate）控制的單基因顯性遺傳。關(guān)媛[2]報道發(fā)現(xiàn)，無毛基因gl對果瘤基因Tu具有隱性上位作用，這表明有毛基因Gl是果瘤形成過程的必要基因。曹辰興等[3]將黃瓜無毛自然突變體命為glabrous（gl1），無毛gl對果瘤性狀Tu具有隱性上位作用，有毛Gl是果瘤形成的必要條件。2014年楊緒勤等[4-5]對黃瓜果瘤基因Tu進行了精細定位，將Tu基因定位于兩翼標記SSR7和SSR18之間，并獲得候選基因31個，并表明Csa016861是Tu的候選基因，控制果瘤性狀，Tu編碼C2H2型鋅指蛋白，刺是果瘤形成的條件。Tu可能是擬南芥ZFP6的直系同源基因，也可能調(diào)控CTK的合成。同年，任國良等[6]通過構(gòu)建黃瓜果瘤基因（Tu）表達載體pCAMBIA2301-Tu，并且將pCAMBIA2301-Tu利用電擊法成功導入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，進行農(nóng)桿菌介導的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究，試驗成功獲得了8株陽性轉(zhuǎn)化苗，轉(zhuǎn)化效率為1.37%。2009年張微微等[7]、2013年蔡潤等[8]和楊緒勤等[9]申請了關(guān)于黃瓜果瘤基因研究的相關(guān)專利，填補了我國黃瓜果瘤性狀基因研究空白。有學者對細胞壁的組分以及結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)其在植物生長發(fā)育和環(huán)境脅迫等領域都起到一定作用[10]并且通過蛋白組學對植物信號傳導的作用機制進行研究[11]。黃瓜瓜把上的果瘤位置是重要的外觀品質(zhì)性狀，但關(guān)于黃瓜果瘤位置的相關(guān)研究未見報道。筆者研究黃瓜果瘤位置遺傳規(guī)律，解析緊密連鎖的QTL標記，為果瘤位置相關(guān)基因功能研究奠定基礎，為品質(zhì)育種提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

以黃瓜課題組多代純合黃瓜果瘤上移自交系X1為母本（P1）、果瘤下移自交系X2為父本（P2）進行雜交，獲得F1、F1反、F1自交構(gòu)建F2群體。采用穴盤育苗，2葉1心時定植，雙高壟地膜覆蓋，大行距80 cm，小行距50 cm，株距25 cm，所有材料定植于河北科技師范學院園藝科技學院園藝實驗站黃瓜課題組普通日光溫室，常規(guī)管理。

1.2 方法

2019年春季，于盛果期分別取父本、母本、F1與F2群體單株主蔓10節(jié)以上的商品瓜，測定果瘤位置，每株測5個商品瓜。具體測量方法為：①用直尺測量商品瓜瓜蒂至果瘤最底部的距離，即外瓜把長（L1）;②將果實縱切，測量種腔底部至瓜把端部的距離，即內(nèi)瓜把長（L2）;③果瘤位置（TP）=L1-L2。TP為負值表明果瘤上移，為正值表明果瘤下移（圖1）。

1.3 QTL定位方法

1.3.1 BSA混池構(gòu)建 根據(jù)黃瓜果瘤位置表型鑒定數(shù)據(jù)，選擇F2群體中果瘤位置極端上移和極端下移單株各20株，取健康植株25節(jié)以上伸展葉片質(zhì)量約1 g，提取DNA，進行等量混合，構(gòu)建果瘤上移池（Tu-up，Tu）、果瘤下移池（Tu-down，Td）。分別取父本、母本葉片，采用同樣方法，構(gòu)建母本池（P1）和父本池（P2）。

1.3.2 文庫構(gòu)建和測序 將檢驗合格的DNA樣品通過Covaris破碎機隨機打斷成長度為350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit建庫，DNA片段經(jīng)末端修復、加ployA尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。將構(gòu)建好的文庫利用Illumina HiSeqTM PE150進行測序。

1.3.3 對生物信息進行分析 對原始數(shù)據(jù)（Raw data）進行質(zhì)控，獲得有效數(shù)據(jù)（Clean data）。之后與黃瓜參考基因組進行對比，標記并注釋SNP、InDel。以母本（P1）的基因測序序列作為參考標準，分別計算果瘤上移池和果瘤下移池在親本間標記位點的SNP-index。其中，完全與母本（P1）相同的SNP-index為0;完全與母本（P1）不同的SNP-index為1。按公式△（SNP-index）=SNPindex（果瘤下移）-SNPindex（果瘤上移）計算參考Takagi[12]。

1.3.4 候選基因分析與預測 利用擬南芥數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）和黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/）對定位到的黃瓜果瘤位置相關(guān)基因進行同源比對，預測候選基因功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜果瘤位置性狀遺傳規(guī)律分析

黃瓜果瘤位置表型數(shù)據(jù)分析表明，P1平均值均為負值，為果瘤上移，P2平均值均為正值，為果瘤下移;F1傾向于母本，F(xiàn)1反傾向于父本（表1），F(xiàn)2表型數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布（圖2），在5.22～6.14間為高親值（接近父本），在0.23～2.32間為低親值（接近母本），說明黃瓜果瘤位置性狀為數(shù)量性狀遺傳。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

混池構(gòu)建方法：選擇果瘤位置極端上移和極端下移單株各20株，構(gòu)建果瘤上移池（Tu-up，Tu）、果瘤下移池（Tu-down，Td）。其中果瘤下移池（Td）數(shù)值與親本池（P2）數(shù)值相近，平均值為5.54（表2）。

對親本P1、P2及果瘤上移混池（Tu）和果瘤下移混池（Td）開展全基因組重測序，共得到25.126 G原始數(shù)據(jù)，過濾后4個樣本有效數(shù)據(jù)量在4 168 933～8 197 167 M，總數(shù)據(jù)量為24.846 G。利用測序結(jié)果的Qphred數(shù)值（Phred Score，Q），計算堿基錯誤率，發(fā)現(xiàn)Q20≥95.47%、Q30≥89.64%，黃瓜果瘤位置QTL-Seq數(shù)據(jù)有效率在98%以上，說明測序質(zhì)量高，GC含量在38.59%～39.12%之間（表3），可進行下一步分析。

以黃瓜基因組作為參考基因組，所有樣本的Reads比對數(shù)/Reads總數(shù)在94.32%～95.51%之間，對參考基因組的平均覆蓋深度在14.82 X～27.17 X之間，1 X覆蓋度比率在98.3%以上，4 X覆蓋度比率在91.30%以上（表4）。

2.3 黃瓜果瘤位置QTL定位

以親本P1作為參考親本，分析計算果瘤上移池與果瘤下移池在親本間72 287個標記位點的SNP-index（即SNP的頻率）?！鱏NP-index =SNP-index（果瘤上移池）-SNP-index（果瘤下移池）。以7條染色體位置為橫坐標，以1 Mb為單位，1 kb為步長，繪制Tu池。根據(jù)混池之間基因頻率差異篩選，對果瘤上移（Tu）與果瘤下移池（Td）間SNP和Indel進行統(tǒng)計。

SNP統(tǒng)計中2個子代池共有130 541個位點發(fā)生SNP突變，在外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)同義突變3 858個，非同義突變3 409個，終止子提前76個，終止子丟失16個，Ts/Tv為1.600。

InDel統(tǒng)計中2個子代池共有77 059個位點發(fā)生SNP突變，缺失造成的移碼有191個，非缺失造成的移碼有136個，插入造成的移碼有236個，非插入造成的移碼133個（表5）。

2.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計2個極端混池測序的SNP-index和InDel-index，并計算子代池|△All-index|，通過設定Top5%的閾值，在95%的置信水平下，共檢測到3個，為1號染色體（7.802～18.383 Mbp）、4號染色體（0.810～18.389 Mbp）和5號染色體（16.259～21.182 Mbp）。

以△SNP-index大于閾值的窗口作為候選區(qū)間，共檢測到2個QTL區(qū)間，分別位于1號染色體（QTL1：2.741～18.376 Mbp）、5號染色體（QTL2：12.896～12.897 Mbp）。

以△InDel-index大于閾值的窗口作為候選區(qū)間，共檢測到3個QTL區(qū)間，分別位于1號染色體（QTL3：5.840～20.316 Mbp）、4號染色體（QTL4：19.698～24.233 Mbp）、5號染色體（QTL5：3.165～20.574 Mbp）。

以上檢測到的5個QTL區(qū)間，1號染色體中QTL1與QTL3重疊，5號染色體中QTL2與QTL5重疊，說明此區(qū)間為可靠性較高，應為重點關(guān)注QTL區(qū)間。推測重疊區(qū)域1號染色體（5.840～18.376 Mbp）、5號染色體（12.896～12.897 Mbp）為果瘤位置性狀的候選區(qū)域（圖3）。

2.5 候選基因的同源基因功能分析與預測

根據(jù)黃瓜基因組3個QTL的△SNP-index、△InDel-index、△All-index在染色體上的分布區(qū)間內(nèi)共獲得候選多態(tài)性標記位點50個，提取ANNOVAR的注釋結(jié)果，共獲得與黃瓜果瘤位置性狀相關(guān)的候選基因16個，含有4個SNP位點，分別位于1號染色體、5號染色體上，12個InDel位點分別位于1號染色體、4號染色體和5號染色體上（表6）。

預測到的候選基因主要與細胞的新陳代謝（CsaV3_1G009410、CsaV3_1G012820、CsaV3_1G028340）、信號轉(zhuǎn)導（CsaV3_1G012480、CsaV3_4G029960、CsaV3_1G030640、CsaV3_1G029520、CsaV3_1G004360）、結(jié)構(gòu)蛋白（CsaV3_1G030620、CsaV3_5G004870、CsaV3_1G031140），以及激酶（CsaV3_1G033300、CsaV3_4G034190）和植物激素（CsaV3_5G015510）有關(guān)。

根據(jù)△All-index在染色體上的分布推斷位于1號染色體（13.76～17.60 Mbp）的CsaV3_1G030610、CsaV3_1G029520和CsaV3_1G030640為候選目的基因。CsaV3_1G030610中的阿魏酸與細胞壁形成有關(guān)。CsaV3_1G029520中的擬南芥SMAX1家族基因，作為KAR/SL信號分子調(diào)控種子萌發(fā)、根毛的形成與伸長。CsaV3_1G030640編碼與ARIA相互作用的ap2結(jié)構(gòu)域蛋白ADAP，正調(diào)控ABA信號，進而影響生長發(fā)育。結(jié)合擬南芥功能注釋得到3個主要的候選基因（CsaV3_1G029520、CsaV3_1G030640和CsaV3_1G030610），因此推測果瘤位置形成候選基因與細胞壁及信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

近年來，對于黃瓜的黑色果刺[13]、果肉厚度[14]、果皮光澤[15]、嫰果皮色[16]等性狀都有相應的研究，但未見對黃瓜果瘤位置精細定位的研究報道。關(guān)媛[2]提出TTG1與黃瓜TTG1-Like同源，與表皮毛形成有關(guān)。2007年王桂玲等[1]研究篩選到5對與果瘤有關(guān)的SSR引物，試驗研究發(fā)現(xiàn)，Tu基因主要位于4個標記構(gòu)建的連鎖群中，其中具體位置為CSWGATT01C-Tu-CSCT335，兩側(cè)標記的遺傳距離為20.0 cM和14.1 cM。2013年任國良[17]利用圖位克隆的方法克隆得到控制黃瓜果瘤性狀的基因Tu，且發(fā)現(xiàn)Tu基因的完全缺失導致無果瘤性狀的發(fā)生。楊緒勤[4]提出了黃瓜果實刺瘤性狀形成的遺傳網(wǎng)絡機制，通過細胞學與外觀形態(tài)觀測，表明開花前2 d為果瘤起始階段期，驗證了Csa016861就是Tu基因，控制果瘤性狀，Tu基因僅含有一個外顯子，Tu基因為編碼C2H2型鋅指蛋白的基因。

本研究結(jié)果得到的候選基因變異類型均為上游區(qū)域（up-stream）變異。上游基因位于起始密碼子之前，即5'端，包含啟動子、操縱子等，主要起調(diào)控目的基因作用。擬南芥乙醛脫氫酶AtALDH1a（CsaV3_1G030610）催化松柏醛和芥子醛生成阿魏酸和芥子酸。阿魏酸（ferulic acid）與纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有關(guān)[18]，參與細胞壁的形成。

綜上所述，推測位于1號染色體重疊區(qū)域（5.840～18.376 Mbp）候選基因CsaV3_1G030610主要參與細胞壁形成，與果瘤有關(guān)聯(lián)，推測其與黃瓜果瘤位置性狀有關(guān)系，但還需進一步研究。

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