房利利，張 永

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，安徽 蚌埠 233000)

感染性疾病是世界公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，在2016年的全球健康評估中，下呼吸道感染仍然位居低收入國家死亡首位，嚴重威脅著人類的生命健康[1-2]。目前，臨床常用的病原學檢查技術(顯微鏡檢查、培養(yǎng)、血清學及傳統(tǒng)分子生物學手段)常常存在陽性率低、漏診率高、時效性差等局限。病原學診斷不明確導致治療延后、藥物濫用、耐藥性增加、經驗抗感染治療等現象。因此，肺部感染病原學的精準診斷對于優(yōu)化抗感染治療至關重要。二代測序技術的出現開啟了微生物宏基因組學領域，也開啟了感染性疾病病原體的精準診斷新篇章。

1 二代測序技術(next-generation sequen-cing,NGS)

二代測序也稱為高通量測序或大規(guī)模并行測序，該方法使得數以億計的基因片段同時或獨立測序，可以從時間、效率和成本上讓微生物組研究成為可能。該技術總體可分為宏基因組測序(metagenomics next-gennerationsequencing,mNGS)和靶向擴增子測序(targeted-ampliconsequencing,TAS)，其一般測序流程包括標本中核酸提取、DNA和(或)RNA富集、文庫制備、高通量測序和生物信息學分析等。mNGS是對整個DNA和/或RNA(轉錄成cDNA后)進行測序(DNAseq和RNAseq)。mNGS可在一個單一的測試中鑒定出幾乎所有的病原體，包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲[3]，且可以識別罕見及新發(fā)現的病原體。此外，測序數據還可以間接用于其他的分析，例如通過RNAseq獲取轉錄組基因數據來分析微生物特征和人類宿主反應。然而mNGS是大海撈針，因為只有小部分(通常小于1%)的測序讀數是非人類的，且其中只有小部分可能與潛在的病原體相對應。因此，該方法的敏感性依賴于背景菌群水平。TAS具有增加測序數據中病原菌序列數和比例的優(yōu)點。靶向測序是使用高度保守的引物進行一般PCR擴增，然后從臨床樣本中檢測與特定類型相對應的所有微生物，如：用于檢測細菌的16S核糖體RNA的基因擴增，以及用于檢測真菌的18S核糖體RNA和內轉錄間隔區(qū)(ITS)的基因擴增。靶向NGS方法的另一個例子是設計橫跨基因組的引物，促進PCR擴增，以便直接從臨床樣本中獲得病毒基因組[4]。已有許多醫(yī)院已經將該技術引用到臨床樣本檢測中，從而增加了感染性疾病診斷的數量和比例[5]。mNGS是對樣本中所有基因組進行測序，具有廣覆蓋優(yōu)勢，可以識別病毒、細菌、真菌、寄生蟲、少見及新的病原體，并且它可以擴展微生物種群的特征，包括亞型、抗生素耐藥性和致病基因的攜帶。TAS是針對特定微生物種群進行檢測，相較于宏基因組測序，其測序深度較深、花費相對較低，但它無法分類到具體物種，且受到檢測范圍的限制(如只能檢測細菌或真菌，甚至僅檢測分枝桿菌)以及需要對檢測樣本有預先判斷。隨著NGS和生物信息學的日益普及，宏基因組技術作為一種新型的感染性疾病診斷方法正逐步得到應用。

2 下呼吸道存在的正常菌群

目前人們認為健康人的下呼吸道由多種微生物組成的動態(tài)穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，這些微生物也包括潛在的致病菌。下呼吸道微生物主要來源于口咽部的微吸入、周圍空氣的吸入及黏膜表面的直接彌散。肺部微生物組接近于口腔微生物組，但又存在不同：口腔微吸入在夜間達到頂峰，在白天逐漸減弱，移入速度減慢，清除作用增強。這種晝夜變化導致了肺部微生物組與口腔微生物組的不同。呼吸道微生物組在早期生命中是動態(tài)發(fā)展的，與出生方式、喂養(yǎng)方式、抗生素使用、生存環(huán)境等有關[6]。健康人肺內存在氧分壓、PH值、溫度等生理參數細微區(qū)域變化，但目前研究并未發(fā)現健康人肺內微生物存在明顯的差異[7]。Morris等人對美國8個城市的健康受試者的肺微生物組的分析研究表明[8]，在吸煙者和不吸煙者的口腔中，卟啉單胞菌屬Porphyromonas、奈瑟菌屬Neisseria及孿生菌屬Gemella等菌群存在差異，但下呼吸道菌群中沒有明顯差異，并且沒有發(fā)現明顯地域差距。Hilty及Molyneaux等人對英國健康人肺部微生物的研究表明，其中檢測到的最豐富的微生物與美國健康受試者相似[9]。綜上所述，雖然健康人肺部菌群受多種因素的影響具有個體差異，但是在總體上具有相同的特點。在健康人的下呼吸道廣泛存在著多種細菌，包括擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、梭桿菌門Fusobacteria、放線菌門Actinobacteria，其中以擬桿菌門(普氏菌屬Prevotella)及厚壁菌門(韋榮氏球菌屬Veillonella、鏈球菌屬Streptococcus)為主[8]。有研究者發(fā)現，相比于口腔，Tropherymawhipplei在肺中相對富集[7-8]。對于健康人肺部真菌組及病毒組微生物的相關研究較少，在健康人的肺內發(fā)現的真菌組最常見的是Davidiellaceae科，枝孢菌屬Cladosporium、散囊菌屬Eurotium、青霉屬Penicillium、曲霉菌屬Aspergillus、念珠菌屬Candida、新薩托菌屬Neosartorya、馬拉色霉菌屬Malassezia、絲齒菌屬Hyphodontia、克魯維酵母屬Kluyveromyces和肺囊蟲屬Pneumocystis等[10]。健康人肺部真菌組的個體差異較大，即使罹患同一種疾病，不同患病個體的真菌群落有較大差別。對健康人肺部病毒組的研究表明主要以噬菌體及Anelloviridae家族成員為主[11]。

3 在下呼吸道感染診斷中的應用

隨著二代測序技術的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現健康人“無菌的肺部”也存在多種微生物，若肺部微生物多樣性降低或部分微生物豐度異常增高，會打破了微生物的動態(tài)平衡及免疫穩(wěn)態(tài)而導致肺炎發(fā)生[12]。近些年來NGS應用于肺部疾病的研究也越來越廣泛，包括肺囊性纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、下呼吸道感染等，其中mNGS應用于下呼吸道感染顯示出巨大優(yōu)勢。胡必杰等人[13]對成人感染性疾病樣本同時進行的mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測，回顧性診斷為感染性疾病有347例，其中有255例(73.5%)診斷為下呼吸道感染。研究發(fā)現：mNGS診斷感染性疾病的敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法(50.7% vs 35.2%；P<0.01)，而特異性無明顯差異(85.7% vs 89.1%；P=0.39)；對于結核分枝桿菌、病毒、厭氧菌及真菌微生物的診斷價值優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)；此外，mNGS較少受以往接觸抗生素的影響。聯合采用針對DNA和RNA的檢測手段(DNAseq與RNAseq)，Langelier等人[14]采用該方法對氣道樣本病原菌的確定具有更高的敏感度與特異度(100%和87.5%)，且RNAseq在78%的已鑒定微生物中產生了更豐富的序列，平均每個微生物的讀數是DNAseq的2.2倍，說明RNAseq在發(fā)現潛在致病微生物方面可能更具有優(yōu)勢。針對兒童下呼吸道感染診斷價值的研究，Farnaes等人[15]對15名診斷為社區(qū)獲得性肺炎兒童進行了游離血漿測序，與傳統(tǒng)檢測方法相比，mNGS具有較高的敏感性(86% vs 47%)，而且，在這15名兒童中，有7名因mNGS結果改變了抗生素治療方案。說明mNGS亦可以提高兒童下呼吸道感染病原菌的檢出率，有利于精準診療的臨床實施。對于免疫缺陷患者下呼吸道感染的研究，Zinter等人[16]對34名免疫缺陷兒童的下呼吸道標本進行mNGS，結果在以前臨床診斷呈陰性的樣本中，有一半檢測出了潛在病原菌，因此，mNGS對于呼吸道病原體檢測敏感性大大提高。Leo等人[17]對一名白血病造血干細胞移植后出現肺部感染的成人患者的肺泡灌洗液進行mNGS，結果發(fā)現該技術可顯著提高對細菌和真菌的檢出率，并且可以識別出常規(guī)檢測方法不能檢測到的厭氧菌和病毒。除此之外，有研究進一步發(fā)現mNGS可更早更準確地發(fā)現成人肺移植后免疫缺陷患者病毒的檢出率，對于特殊人群下呼吸道感染病原學確定意義重大，不僅可以早期實施精準治療，還能改善免疫缺陷患者的臨床預后。

除了上述呼吸道標本，李荷蘭等[18]對20例肺組織標本進行了mNGS，其中有15例被mNGS成功鑒別出感染性病原菌。相對于組織病理學方法，mNGS對結核分枝桿菌復合群、真菌具有較高的敏感度與特異度(100%和90%；94.1%和100%)。相對于培養(yǎng)方法，mNGS對細菌和真菌陰性預測值較高(100%和72.7%)；但同時發(fā)現其陽性預測值偏低(細菌42.9%，真菌44.4%)，這可能與肺活檢組織增加了人源序列的干擾、樣本量小及測序深度有關。因此，我們也需注意mNGS報告解讀時需要綜合考慮標本中人源序列的影響、緊密結合臨床及背景菌群信息等。

綜上所述，臨床應用mNGS可顯著提高肺部感染病原學診斷的敏感性，加強人們對罕見及新發(fā)現病原菌的認識。在病因不明、抗生素暴露、免疫缺陷等患者的病原學診斷中具有更高的指導意義，為精準診療帶來了希望。但是人們也發(fā)現一些存在的問題，比如：難以排除人源序列的干擾、外源微生物污染、DNA/RNA流程不能合并檢測、未優(yōu)化的檢測流程對檢測周期的影響、測序價格昂貴等問題一定程度上影響或限制了mNGS在臨床疾病中的應用。例如，相對于無細胞體液，組織來源的樣本增加了背景菌群，導致微生物測序讀數的數量和比例減少，從而降低了mNGS的敏感性[19]。

4 未來臨床應用及研究熱點展望

目前將mNGS應用于臨床感染性疾病診斷的研究越來越多，其中該技術在呼吸道疾病中的研究成為新近的研究熱點。新型技術為克服mNGS的檢測時效性的技術瓶頸帶來希望，比如Charalampous等新開發(fā)的針對細菌性下呼吸道感染的納米孔測序[20]可以高效移除宿主DNA，并在6h內準確識別病原體和抗生素抗性基因。除此之外，宏基因組未來發(fā)展還需關注以下幾個研究方向：利用RNAseq檢測宿主轉錄組評估臨床感染相關性、檢測微生物耐藥基因和毒力因子、DNAseq與RNAseq流程合并等。相信不久的將來，隨著宏基因組技術在臨床感染性疾病應用中的不斷深入與發(fā)展，形成一系列規(guī)范操作流程及解讀標準，mNGS將會成為被廣泛普及的一種病原菌檢測方式，指導臨床醫(yī)師優(yōu)化調整抗菌藥物，助力解決抗感染治療領域的世界性難題。