劉思瑩，任蓁，凌爽，牛文穎，王雨晴，郭婉琴，肖洪彬

1黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學；3黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院

高脂血癥是動脈粥樣硬化、心血管疾病、糖尿病等疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，糾正高脂血癥對于預防心腦血管疾病具有重要意義。高脂血癥的發(fā)生機制復雜，包括脂蛋白的吸收、抑制合成和促進排泄等多種因素的相互作用，使用單一靶向藥物治療效果不佳。中藥中多組分的降脂作用可能參與脂質(zhì)代謝調(diào)控的各個步驟，對正常脂質(zhì)合成和代謝可能具有重要意義。目前許多中藥都被用于調(diào)節(jié)血脂，治療心腦血管疾病[1]。因此，開發(fā)中藥多靶點、多途徑治療對防治高脂血癥具有重要意義。燈盞花素是從燈盞細辛中提取的一種黃酮類有效成分，其主要成分為燈盞花乙素。燈盞花乙素具有較強的生物學活性，亦是臨床上常用的單體化合物成分，已被制成多種劑型用于治療心腦血管疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病、腦供血不足、心絞痛等[2，3]。臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，燈盞花乙素可調(diào)節(jié)血脂、降低血液黏度、提高機體抗缺氧能力，從而延緩心腦血管疾病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[4，5]。2020年3～5月，本研究嘗試通過網(wǎng)絡藥理學分析，探索燈盞花乙素治療高脂血癥潛在的分子機制，為其臨床應用及高脂血癥相關疾病的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，Protein Data Bank(PDB，https://www.rcsb.org/)，Pharmmapper平臺服務器(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/check.php)，Venny2.1軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，String11.0軟件(https://string-db.org/)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)。

1.2 化合物-靶點基因-疾病網(wǎng)絡的構建 通過Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索燈盞花乙素(Scutellarin)的3D化合物化學結構，下載保存為mol2格式并上傳到Pharmmapper平臺服務器，獲取藥效團文件，通過手工檢索、聯(lián)合uniprot數(shù)據(jù)庫和使用Perl腳本，尋找藥效團對應靶點，物種限定為“Homo sapiens”。最后將獲取的靶點合并去重，即為燈盞花乙素潛在作用靶點。以“Hyperlipidemia”為關鍵詞，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中篩選出高脂血癥相關靶基因，得到疾病相關的靶點基因。將燈盞花乙素化合物潛在靶點基因和疾病靶點基因同時導入Cytoscape3.7.2軟件，構建化合物-靶點基因-疾病網(wǎng)絡，最后運用Network Analyzer功能分析其拓撲學屬性。

1.3 燈盞花乙素作用靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構建 通過Venny2.1軟件，提交疾病和藥物靶點，獲取兩者共同作用靶點。將篩選得到的共有靶點基因上傳至String平臺，建立PPI網(wǎng)絡，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，隱藏網(wǎng)絡中孤立的蛋白，其他參數(shù)保持默認設置，導出PPI網(wǎng)絡圖，分析統(tǒng)計靶點蛋白關聯(lián)頻次。將String平臺篩選出來的具有相互作用功能的基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件，通過拓撲網(wǎng)絡中cytoHubba插件中最大派系中心度分析并篩選出燈盞花乙素治療高脂血癥的核心靶點基因。

1.4 核心靶點基因的GO生物過程及KEGG通路富集分析 將上述方法篩選出的PPI網(wǎng)絡核心靶點基因利用R cluster Profiler包進行基因本體GO生物過程注釋和KEGG通路富集分析，以P<0.05且從小到大排序，選取前20個GO生物過程注釋及KEGG通路。利用R ggplot2包繪制相應圖形。

1.5 燈盞花乙素與核心靶點蛋白的分子對接 分子對接技術是驗證分子和靶點作用關系的有效途徑，將燈盞花素活性成分作為配體、PPI網(wǎng)絡中degree前6位的靶點作為受體，進行分子對接。在PubChem CID下載燈盞花乙素活性成分的三維結構，在PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白結構，用小分子結構繪制軟件ChemBioDrew對其進行常規(guī)預處理，然后用Pymol軟件刪除多余的蛋白結構，去掉水分子以及其他無關配體，導入AutoDock Vina1.1.2軟件選擇半柔性對接模式，對接參數(shù)為默認。其中，結合能小于0表明配體分子能夠和受體蛋白自發(fā)結合，結合能小于-5.0 kJ/mol，表明其結合性好，結合能越小則對接越好[6]。

2 結果

2.1 化合物-靶點基因-疾病網(wǎng)絡構建情況 共獲得化合物靶點基因366個，疾病靶點基因1 280個，構建化合物-靶點基因-疾病網(wǎng)絡，獲得疾病基因與化合物靶點基因映射，篩選出共同作用靶點基因39個，確定為燈盞花乙素治療高脂血癥的的靶點基因。包括E3-SUMO蛋白轉(zhuǎn)移酶NSE2(NSMCE2)、NLR家族含3的Pyrin域(NLRP3)、脂肪酸合酶(FAS)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶(ABCA1)、δ-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)、C反應蛋白(CRP)、細胞色素P450 7A1(CYP7A1)、羧肽酶B2(CPB2)、胰腺三酰甘油脂肪酶(PNLIP)、膜伯胺氧化酶(AOC3)、Krueppel樣因子2(KLF2)、髓過氧化物酶(MPO)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、G1/S特異性細胞周期蛋白D1(CCND1)、DNA連接酶4(LIG4)、3磷酸甘油脫氫酶1樣蛋白(GPD1L)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)、線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、中鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶(ACADM)、糖原磷酸化酶(PYGL)、E3泛素蛋白連接酶(TRIM21)、基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP14)、肌紅蛋白(MB)、膜相關鳥苷酸激酶(MAGI2)、1,6-雙磷酸果糖酶1(FBP1)、過氧化氫酶(CAT)、核受體共激活劑2(NCOA2)、谷胱甘肽過氧化物酶3(GPX3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(PTGS1)、脂肪酸結合蛋白(FABP2)、雄激素受體(AR)、肌酸激酶M型(CKM)、血管內(nèi)皮生長因子B(VEGFB)、絲氨酸蛋白酶1(PRSS1)。

2.2 PPI網(wǎng)絡及其核心靶點基因 將篩選的39個共有靶點蛋白上傳至String平臺，建立PPI網(wǎng)絡。該網(wǎng)絡共有37個節(jié)點，98條相互作用關系，平均度值為5.38。PPI網(wǎng)絡中degree最高的前6個基因為CAT、CRP、HMOX1、PTGS2、MPO、ACE。

2.3 核心靶點基因GO生物過程及KEGG通路富集分析結果 共有靶點基因主要參與的生物過程包括氧化應激反應、氧氣水平的反應、抗生素反應、缺氧的反應、營養(yǎng)水平的反應、細胞排毒反應等(表1)；涉及的信號通路主要有PPAR信號通路、脂肪的消化吸收、花生四烯酸代謝、TNF信號通路、AMPK信號通路、FoxO信號通路、膽固醇代謝、調(diào)節(jié)脂肪細胞中的脂肪分解等(表2)。

表1 核心靶點基因的GO生物過程分析結果

2.4 燈盞花乙素與靶蛋白分子對接結果 燈盞花乙素與degree較高的6個核心靶點蛋白的活性位點均能夠形成2個以上的氫鍵。燈盞花乙素與CAT、MPO、PTGS2、ACE、HMXO1、CRP的結合能分別為-11.4、-10.8、-10.6、-9.8、-9.5、-8.9 kJ/mol，其中燈盞花乙素與CAT蛋白的結合能最低，結合能力最強。燈盞花乙素能與CAT的活性位點ARG 112、ARG 72、SER 114和TYR 358形成氫鍵，這也是促使其結合到活性位點的主要作用力。

3 討論

高脂血癥的發(fā)生機制非常復雜，多種生物過程和多種信號通路參與了膽固醇的代謝過程。中藥被認為能夠針對炎癥、氧化應激、能量代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮治療高脂血癥的作用。燈盞花乙素是一種黃酮苷類化合物，可通過抗氧化活性來防治非酒精性脂肪肝[7]、動脈粥樣硬化[8]、缺血再灌注損傷[9]、胰島素抵抗[10]等相關代謝性疾病。本研究通過網(wǎng)絡藥理學建立藥物化合物-靶點基因-疾病網(wǎng)絡和核心靶點網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)CAT、HOXM1、CRP、MPO、PTGS2、ACE是燈盞花素治療高脂血癥的核心靶點；PPI網(wǎng)絡分析表明，這些蛋白均處于網(wǎng)絡的核心位置，至少與7個蛋白存在相互作用關系。CAT和HOXM1具有抗氧化、調(diào)節(jié)炎癥反應、促進微循環(huán)等作用[11，12]。CRP是由肝細胞合成和分泌的球蛋白，受炎癥因子調(diào)節(jié)和誘導，是評價炎癥性疾病的指標之一，并參與血栓形成和動脈粥樣硬化的病理過程，是冠心病、腦卒中等疾病的危險因素之一[13，14]。MPO被認為是炎癥反應的標志物之一，在生理條件下MPO參與機體的固有免疫，過量釋放的MPO可誘導機體發(fā)生氧化應激反應，大量超氧化物和氧化物形成，造成機體炎癥部位損傷。有研究表明，MPO通過多種途徑參與動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的全過程[15]。PTGS2是體內(nèi)前列腺素合成的關鍵酶，在正常組織中很少表達，在炎癥組織中呈高表達，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[16，17]。ACE是一種含鋅離子的金屬蛋白酶，能夠催化血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化，使血管收縮而增加血壓。通過抑制ACE使血管緊張素Ⅱ形成減少和緩激肽代謝減少，導致動脈和靜脈系統(tǒng)擴張、動脈血壓降低。目前ACE2研究比較廣泛，它與心血管疾病、動脈粥樣硬化和2型糖尿病等關系密切。ACE主要在動脈粥樣硬化斑塊的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞中有大量表達，這也提示ACE有可能是抗動脈粥樣硬化的重要因素之一[18]。上述結果表明，燈盞花乙素治療高脂血癥是通過多靶點、多途徑來實現(xiàn)的。

表2 核心靶點基因的KEGG通路富集分析結果

從GO富集分析結果可知，差異基因主要參與氧化應激反應、缺氧的反應、抗生素反應、營養(yǎng)水平的反應、細胞排毒反應、細胞氧化劑反應等生物過程。KEEG分析結果顯示，核心靶點基因參與的信號通路主要是PPAR信號通路，其次是脂肪的消化吸收、AMPK信號通路、FoxO信號通路、膽固醇代謝、調(diào)節(jié)脂肪分解等。PPAR參與調(diào)節(jié)肝臟炎癥和脂質(zhì)代謝過程，促進脂肪細胞分化，提高血糖攝取，在動脈粥樣硬化的形成過程中起著重要的作用[19，20]。有研究報道，燈盞花乙素可通過PPARγ/PGC-1α/Nrf2途徑作用于下游靶點CAT、HMOX1，調(diào)控其抗氧化應激信號通路，減少脂質(zhì)過氧化作用，降低高脂喂養(yǎng)大鼠的血脂水平[21]。高脂狀態(tài)下，血脂升高，自由基生成增加，大量的自由基破壞了機體氧化平衡，導致脂蛋白發(fā)生氧化修飾，增強氧化應激和內(nèi)毒素形成，從而造成內(nèi)皮損傷。燈盞花素可能通過干預氧化應激損傷、TNF信號通路和炎癥反應相關信號通路等途徑協(xié)同發(fā)揮治療高脂血癥的作用。我們采用分子對接技術進一步驗證分子和靶點作用的關系，結果顯示，燈盞花乙素與degree較高的6個核心靶點蛋白的活性位點均能夠形成2個以上的氫鍵，結合能力較強，提示燈盞花乙素的作用機制與調(diào)控抗氧化因子和炎癥因子有關。

綜上所述，本研究以燈盞花乙素為研究對象，通過網(wǎng)絡藥理學結合分子對接方法分析了其治療高脂血癥的核心靶點及通路，并初步驗證了燈盞花素與核心靶點的相互作用關系和結合力，揭示了燈盞花素治療高脂血癥具有多靶點、多通路的作用機制。