林軍 蘇林紅 葉小丹 朱小區(qū) 王天嬌

1.溫州市中醫(yī)院 浙江，溫州 325000 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與遺傳易感及胰島素抵抗（insulin resistance，IR）密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷[1-2]。作為全球最常見的慢性肝病，其成人患病率在6.3%～45%[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，因此治療尚缺乏理想藥物。而中醫(yī)藥治療具有改善癥狀、保肝降酶、長(zhǎng)期治療或可逆轉(zhuǎn)脂肪肝等方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，臨床已廣泛用于NAFLD的防治，而且效果顯著[4]。五苓散出自張仲景《傷寒論》，具有利水滲濕、溫陽化氣之功用，臨床研究證實(shí)五苓散治療NAFLD療效顯著[5-6]，但其作用機(jī)制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將化學(xué)信息學(xué)、生物信息學(xué)、傳統(tǒng)藥理學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)、網(wǎng)絡(luò)分析整合到一起的一種新的藥理學(xué)研究方法?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥復(fù)方的有效成分-活性靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行綜合網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，能夠使中藥藥理學(xué)特征概括更為全面，同時(shí)也符合中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)[7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對(duì)五苓散治療NAFLD的有效成分、活性靶點(diǎn)、潛在機(jī)制進(jìn)行探討，并進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，以期為五苓散的藥理作用研究和臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 五苓散中有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái) （traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）對(duì)五苓散有效成分進(jìn)行初步篩選，其中篩選條件為類藥性（drug likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%。 同時(shí)對(duì)篩選出的有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，利用UniProt對(duì)篩選出的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 NAFLD疾病靶點(diǎn)的獲取 以 “non-alcoholic fatty liver disease”作為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards、在線人類孟德爾遺傳 （online mendelian inheritance in man，OMIM）等數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行篩選，獲取NAFLD疾病靶點(diǎn)。

1.3 核心靶點(diǎn)篩選及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將五苓散-NAFLD靶點(diǎn)進(jìn)行映射，利用韋恩圖在線平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html） 篩選核心靶點(diǎn)。利用STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺(tái)（http://string-db.org/）構(gòu)建核心靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，篩選條件設(shè)置：種屬選擇人類、PPI分?jǐn)?shù)為0.4。

1.4 富集分析 將篩選后的核心靶點(diǎn)上傳至Cytoscape 3.7.1軟件，建立化合物-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以展現(xiàn)五苓散對(duì)于NAFLD的作用關(guān)系。為了說明核心靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes，KEGG）通路富集分析，物種限定為人類，閾值設(shè)定為P＜0.05，利用OmicShare云平臺(tái)（https://www.omicshare.com/）將數(shù)據(jù)結(jié)果可視化。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220g，購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（遼）2010-0001]，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥試驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（遼）2019-0004]。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器 五苓散劑量參照全國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《方劑學(xué)》，70kg成人臨床劑量為澤瀉15g、豬苓9g、桂枝6g、茯苓9g、白術(shù)9g。以上藥物均購置于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，將上述藥材晾干并研磨成細(xì)粉，并用120目篩篩選備用。用藥劑量依據(jù)人與動(dòng)物用藥劑量體表面積換算法進(jìn)行計(jì)算，配制成0.504g·mL-1的藥液，實(shí)驗(yàn)前1d以0.9%氯化鈉注射液將其配制成所需濃度。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、p53蛋白、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒均購于武漢菲恩生物科技有限公司 （批號(hào)：ER1393、ER0394、ER0035）；羅氏cobas8000全自動(dòng)生化分析儀及配套檢測(cè)試劑總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）均購自于羅氏診斷產(chǎn)品有限公司。Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購于美國(guó)BioTek公司；TDZ5-WS低速離心機(jī)為湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.5.3 模型制備 30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組10只和造模組20只，空白組予普通飼料喂養(yǎng)，造模組予高脂飼料（基礎(chǔ)飼料88%、豬油10%、膽固醇1.5%、膽鹽0.5%）喂養(yǎng)。按照文獻(xiàn)[8]造模方法進(jìn)行驗(yàn)證，隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行肝臟蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色與血脂測(cè)定，發(fā)現(xiàn)造模組大鼠在第8周末達(dá)到NALFD診斷標(biāo)準(zhǔn)，遂結(jié)束造模。而后將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組與中藥組，每組各8只。

1.5.4 實(shí)驗(yàn)方法 造模成功后，中藥組予五苓散濃縮液灌胃，依據(jù)前期研究確定的最佳給藥劑量，灌胃劑量為0.52g/kg；空白組及模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。3組大鼠連續(xù)灌胃28d，每日早晚各1次。

1.5.5 指標(biāo)檢測(cè) 處死大鼠，采集腹主動(dòng)脈血及肝組織。采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清TC、TG、LDL-C水平；采用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)大鼠肝組織中TNF-α、p53、IL-17表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。取新鮮肝組織行HE染色以觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五苓散中有效成分篩選和靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果 根據(jù)DL、OB參數(shù)在TCMSP中進(jìn)行篩選，共得到五苓散中茯苓、豬苓、澤瀉、白術(shù)、桂枝的有效成分46個(gè)，其中有19個(gè)有效成分未預(yù)測(cè)到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，最終獲得有效成分27個(gè)，有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白62個(gè)。

2.2 NAFLD疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，檢出與NAFLD相關(guān)的已知靶點(diǎn)分別為1 256個(gè)、493個(gè)，刪除檢索結(jié)果中重復(fù)靶點(diǎn)后共納入1 732個(gè)與NAFLD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.3 核心靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 利用韋恩圖在線平臺(tái)將1 732個(gè)NAFLD疾病靶點(diǎn)與62個(gè)五苓散有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行映射，并繪制韋恩圖，篩選得到五苓散治療NAFLD的核心靶點(diǎn)28個(gè)。輸入STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺(tái)，分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，共有27個(gè)節(jié)點(diǎn)（節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)）、83條邊（邊代表靶點(diǎn)間相互作用），最終篩選得到五苓散治療NAFLD的核心靶點(diǎn)27個(gè)。

圖1 五苓散治療NAFLD的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 PPI network of core target of Wuling San in the treatment of NAFLD

2.4 化合物-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將27個(gè)核心靶點(diǎn)、9個(gè)有效成分、中藥（茯苓、豬苓、澤瀉、白術(shù)、桂枝）和疾?。∟AFLD）導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，以構(gòu)建化合物-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中共包含36個(gè)節(jié)點(diǎn) （包括27個(gè)核心靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)以及9個(gè)有效成分節(jié)點(diǎn)）以及42條邊，其中紫色三角形節(jié)點(diǎn)代表有效成分，綠色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 五苓散治療NAFLD的化合物-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Component-disease-target regulatory network of Wuling San in the treatment of NAFLD

2.5 GO功能富集分析結(jié)果 利用DAVID 6.8對(duì)27個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，共得到GO條目190個(gè)，其中生物過程（biological process，BP）條目140個(gè)、分子功能（molecular function，MF）條目28個(gè)、細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目22個(gè)。見圖3。GO功能富集分析結(jié)果顯示，BP主要涉及脂質(zhì)及雌二醇反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等方面，MF主要涉及乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性、半胱氨酸內(nèi)肽酶活性等方面，CC主要涉及等膜筏、突觸前后膜、死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物等方面。

圖3 五苓散治療NAFLD的GO功能富集分析Fig.3 GO functional enrichment analysis of Wuling San in the treatment of NAFLD

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果 利用DAVID 6.8對(duì)27個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到KEGG條目44個(gè)。見圖4。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示五苓散治療NAFLD的通路主要涉及細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。

2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

圖4 五苓散治療NAFLD的KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of Wuling Sanin the treatment of NAFLD

2.7.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化比較 空白組可見肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，無炎性浸潤(rùn)和壞死；模型組可見肝細(xì)胞排列紊亂，脂肪細(xì)胞空泡樣變性及脂質(zhì)沉積，出現(xiàn)明顯炎性浸潤(rùn)和壞死灶；中藥組可見脂肪浸潤(rùn)和少量脂肪細(xì)胞空泡，肝細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和壞死灶顯著減輕。見圖5。

圖5 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化比較（HE染色，400×）Fig.5 Comparison of pathological changes of liver tissue in each group（HE staining， 400×）

2.7.2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見圖6。

圖6 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平比較Fig.6 Comparison of serum TC，TG and LDL-C levels in each group

2.7.3 各組大鼠肝組織TNF-α、p53、IL-17水平比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、p53、IL-17水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠肝組織TNF-α、p53、IL-17水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖7。

圖7 各組大鼠肝組織TNF-α、p53、IL-17水平比較Fig.7 Comparison of TNF-α， p53 and IL-17 levels in liver tissue in each group

3 討論

NAFLD不僅可以導(dǎo)致肝功能障礙殘疾和死亡，還與代謝綜合征、動(dòng)脈硬化性心血管疾病、2型糖尿病及結(jié)直腸腫瘤等密切相關(guān)[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)NAFLD的治療方法仍以改變生活方式及藥物治療為主，近年來針對(duì)NAFLD的藥物研究仍未取得突破性進(jìn)展，而中醫(yī)藥在NAFLD治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。根據(jù)NAFLD的臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，歷代醫(yī)家將其歸屬于 “肝癖”“脅痛”“積聚”“肥氣”“痰濁”等范疇，病因病機(jī)當(dāng)責(zé)之嗜食肥甘厚味，肥甘之品易傷脾氣，脾失健運(yùn)，津液輸布障礙，痰濕壅滯，三焦氣化不利，濕濁內(nèi)停愈甚，痰濕內(nèi)蘊(yùn)于肝，故發(fā)為本病，治當(dāng)化氣利水。五苓散具有利水滲濕、溫陽化氣之功用，方中澤瀉甘淡，直走水腑，助腎與膀胱利水滲濕；二苓淡滲，通調(diào)水道，增強(qiáng)利水滲濕之力；白術(shù)燥濕，健脾助土，既可彰益土制水之效，又可奏輸津四布之功；桂枝辛溫，宣通陽氣，蒸化三焦以行水，既外解太陽之表，又內(nèi)助膀胱氣化。五藥合用，使水行氣化，表解脾健，蓄水留飲自除。因此，為了深入了解五苓散的藥理作用機(jī)制，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)五苓散治療NAFLD的潛在機(jī)制予以探討，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究首先通過篩選挖掘出五苓散治療NAFLD的核心靶點(diǎn)27個(gè)，進(jìn)一步行化合物-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析顯示，β-谷甾醇、二氫槲皮素、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、常春藤皂甙元等藥物有效成分能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)靶點(diǎn)；前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、 類視黃醇X受體α（retinoid X receptor alpha，RXRA）等靶點(diǎn)也能與多個(gè)藥物有效成分形成作用關(guān)系，提示五苓散治療NAFLD作用機(jī)制復(fù)雜多樣，非通過單一靶點(diǎn)起效，具有多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，PPI網(wǎng)絡(luò)亦證實(shí)五苓散與NAFLD各靶點(diǎn)之間關(guān)系密切，研究結(jié)果可信度較高，參考價(jià)值較大。

通過對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，初步預(yù)測(cè)出五苓散通過脂質(zhì)反應(yīng)、ADH活性等功能途徑及TNF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等多條通路途徑發(fā)揮治療NAFLD的作用。NAFLD病理過程中，大量脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，IR則可通過促進(jìn)胰島素分泌過多，進(jìn)而加快脂肪分解，導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，與脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)，是NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[10]。血清酶水平可反映各種肝病的肝細(xì)胞酶活性變化，ADH大量存在于肝臟內(nèi)，可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積、過氧化物產(chǎn)生增多、腸-肝軸代謝毒素增多，進(jìn)而引發(fā)肝臟炎癥，促進(jìn)NAFLD發(fā)生發(fā)展[11]。ADH活性與肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度相關(guān)，NAFLD患者的ADH活性顯著高于健康人。研究證實(shí)NAFLD患者TNF-α表達(dá)水平顯著增加，TNF-α可通過促進(jìn)游離脂肪酸合成，導(dǎo)致脂肪肝；通過誘導(dǎo)炎性因子的釋放，參與脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激過程，誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)；還可通過激活細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、壞死或凋亡，對(duì)脂類代謝過程產(chǎn)生影響[12]。p53作為腫瘤抑制因子，研究表明p53信號(hào)通路對(duì)于NAFLD的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[13]，既可調(diào)控肝細(xì)胞凋亡，又可調(diào)節(jié)肝組織氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝，還可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞衰老過程；此外p53信號(hào)通路與IR、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期阻滯等也聯(lián)系密切[14-15]。IL-17作為炎癥介質(zhì)，可誘導(dǎo)其他炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶與單核細(xì)胞趨化蛋白質(zhì)過度表達(dá)，從而引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷；同時(shí)可參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化，以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[16]。IL-17與NAFLD發(fā)病的關(guān)系主要包括IR、氧化應(yīng)激、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路的激活及肝內(nèi)巨噬細(xì)胞表達(dá)等方面[17]。

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，本研究進(jìn)一步研究了五苓散對(duì)NAFLD模型大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)、血清脂質(zhì)代謝水平、肝組織TNF-α、p53、IL-17表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明五苓散能夠降低NAFLD模型大鼠脂質(zhì)代謝水平，抑制肝組織TNF-α、p53、IL-17表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞變性以保護(hù)肝細(xì)胞，從而達(dá)到治療目的。

綜上所述，五苓散治療NAFLD具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，其主要通過脂質(zhì)反應(yīng)、ADH活性等功能途徑以及TNF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等多條信號(hào)通路發(fā)揮作用，以起到控制NAFLD發(fā)生、發(fā)展的作用；進(jìn)一步經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，五苓散能夠減輕NAFLD模型大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，調(diào)控肝組織TNF-α、p53、IL-17表達(dá)水平可能是其作用機(jī)制之一。本研究結(jié)果為后續(xù)研究五苓散治療NAFLD的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為未來探討中醫(yī)藥科學(xué)性提供了研究方法。