相雯研，張娟*，堵國成，李少壘，顧芷瑋

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(福建安麥高新生物技術(shù)有限公司，福建 泉州，362200)

烘焙食品是一種方便快捷的食物，成為滿足快節(jié)奏生活的食物選擇之一[1]，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]，依據(jù)烘焙市場規(guī)模預測，2020年我國烘焙食品行業(yè)銷售額可達5 500億元，發(fā)展空間巨大[4]。烘焙食品在制作過程中需要使用發(fā)酵劑，是為面團提供醒發(fā)力的起酵物[5]，決定了烘焙產(chǎn)品的品質(zhì)[6-8]。目前市場上主要的發(fā)酵劑為即發(fā)活性干酵母，天然酵母占比較少。為延長使用即發(fā)活性干酵母制作的烘焙產(chǎn)品的保質(zhì)期、改善其口感、外觀，大量食品添加劑加入其中，隨之帶來潛在的食品安全問題[9]。與即發(fā)活性干酵母相比，天然酵母來源天然，改善烘焙食品的感官與接受度，可提升烘焙產(chǎn)品品質(zhì)[10-11]。

天然酵母中主要微生物為酵母菌和乳酸菌[3, 8]，乳酸菌在不同天然酵母中微生物組成存在很大差異[12-14]，其中常見的菌株有植物乳桿菌[6]、干酪乳桿菌[15]等，這些乳酸菌除了能夠為烘焙食品帶來優(yōu)良風味外[5, 15]，還可以有效延長儲存期[5, 11]、增強質(zhì)構(gòu)特性[6]、營養(yǎng)吸收能力[7]；酵母菌以能夠產(chǎn)生大量CO2而成為主要提供發(fā)酵力的菌種[16]，此外酵母菌對流變特性和風味組成也有重要作用[11]。然而現(xiàn)階段天然酵母在使用時需以天然發(fā)酵物作為發(fā)酵劑如酸面團、水果發(fā)酵液等[17-19]，存在平均醒發(fā)時間長的問題[20-21]，為天然酵母的應(yīng)用帶來了阻礙。

本研究針對目前天然酵母成本高、發(fā)酵活力低、醒發(fā)時間長的問題，以發(fā)酵食品作為菌株來源，經(jīng)篩選、烘焙性能測定，篩選獲得了1株醒發(fā)、風味、組織結(jié)構(gòu)、貯藏性能較好的酵母菌，將獲得的酵母菌進行烘焙性能強化，獲得了1株快速醒發(fā)的烘焙酵母，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化及過程放大培養(yǎng)條件優(yōu)化最終獲得了一種高活菌數(shù)烘焙酵母的生產(chǎn)方式，為高性能天然酵母在烘焙行業(yè)的應(yīng)用奠定了較好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20, 葡萄糖20，酵母浸粉10；

YPD固體培養(yǎng)基：在YPD培養(yǎng)基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂粉；

菌體篩選培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10 KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，孟加拉紅0.03，氯霉素0.1；

高葡萄糖培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖，蛋白胨20, 酵母浸粉10；

高鹽培養(yǎng)基(g/L)：NaCl，葡萄糖，蛋白胨20, 酵母浸粉10。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，Mettler-Toledo公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海醫(yī)療器械研究所；Qpix420微生物篩選系統(tǒng)，美谷分子公司；多孔板搖床，Heidolph公司；酶標儀，Biotek 公司； PTC-200型聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerrase chain reaction，PCR)儀，Bio-Rad公司；攪拌機、醒發(fā)箱、電烤箱，無錫新麥機械有限公司；顯微鏡，Nikon公司；pH 計，梅特勒公司；CF16RX冷凍立式離心機，Hitachi公司；15 L發(fā)酵罐，迪必爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

收集樣本，隨機取樣采集樣本，裝入50 mL無菌管中，儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌種的分離篩選

取樣品適量加入YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)24 h后稀釋100倍于 YPD 固體培養(yǎng)基涂布，30 ℃培養(yǎng)48 h，使用微生物篩選系統(tǒng)Qpix420將YPD固體培養(yǎng)基上單菌落轉(zhuǎn)接于裝有YPD培養(yǎng)基的96深孔板中，培養(yǎng)24 h，同等條件轉(zhuǎn)接培養(yǎng)1次，選取OD600>0.5的菌液進行劃線純化培養(yǎng)。經(jīng)3～5次劃線培養(yǎng)獲得單一菌株，觀察菌落、菌體形態(tài)[22]。將菌株以10% 接種量接種至裝有杜氏管的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)4 h觀察產(chǎn)氣情況[23-24]。

1.2.3 菌種烘焙性能分析

從YPD固體培養(yǎng)基上挑取菌落接種至1 mL YPD培養(yǎng)基中，以10% 接種量、 30 ℃下培養(yǎng)12 h進行逐級放大培養(yǎng)，最終獲得菌液500 mL，6 000 r/min離心7 min收集菌體。按照表1方式進行甜面包及軟歐包制作。

表1 面包制作配方表 單位：g

選取醒發(fā)時間、組織形態(tài)、氣味、口感、貯藏性能5方面作為評定指標，按照表2的指標進行評定，每個試驗重復3次，平行測定2次取平均值，評定最終得分以均值來記[25]。

1.2.4 菌種鑒定

取甘油保藏的酵母菌LBBE-1 10 μL于PCR管中，微波爐高火加熱5 min制成PCR擴增反應(yīng)模板進行擴增，其中使用的酵母菌ITS擴增通用引物如表3所示。測序后使用BLAST將測定的ITS序列與GeneBank中酵母菌系列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

表2 面包的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for bread

表3 酵母菌 ITS通用引物序列Table 3 Yeast ITS common primer sequence

1.2.5 菌種烘焙性能強化

首先對菌株LBBE-1進行耐糖馴化，將種子液接種于100 g/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基24深孔板中，在30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，測定OD600值，選取菌濃較大的3株菌取平均值記為馴化1 d菌濃，并接種至24孔板中；重復上述操作，待測定菌濃達到與YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有同等水平時提升葡萄糖濃度至更高水平(以100 g/L為步階)，直至在300 g/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基中能夠正常生長。再將獲得在300 g/L葡萄糖中正常生長的3株菌接種至含有10 g/L NaCl的高鹽培養(yǎng)基24深孔板中，在30 ℃、220 r/min培養(yǎng) 24 h，測定OD600值，選取菌濃較大的3株菌取平均值記為馴化1 d 菌濃，并接種至24孔板中；重復上述操作，待測定菌濃達到與YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有同等水平時提升NaCl濃度至更高水平(以5 g/L為步階)，直至在含有20 g/L NaCl的高鹽培養(yǎng)基中能夠正常生長。按照烘焙性能測定同等方式進行馴化菌株烘焙效果。

1.2.6 菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化及放大培養(yǎng)

為滿足工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，將菌株進行發(fā)酵優(yōu)化及放大培養(yǎng)。將甘油管中的菌液接種至YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h以獲得種子液。搖瓶水平分別進行最適生長接種量、pH、溫度、葡萄糖濃度、氮源測定，并測定菌株的生長曲線[26]。以優(yōu)化配方作為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基在15 L發(fā)酵罐上進行控制條件優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離與篩選

以天然葡萄發(fā)酵液、開菲爾粒、紅茶菌(北京、廣州、哈爾濱)為樣本進行菌體富集培養(yǎng)，經(jīng)微生物篩選系統(tǒng)Qpix420篩選獲得1 651株菌，以0.1 g/L氯霉素作為去除細菌干擾、獲得酵母菌的篩選條件，最終獲得12株酵母菌，其菌落形態(tài)如表4、圖1所示，產(chǎn)氣速率以杜氏管產(chǎn)生氣體體積差異作為評分標準，進行觀察測定。

圖1 篩選和馴化菌株的形態(tài)特征圖Fig.1 Comparison of morphological characteristics of screened and domesticated strains

2.2 菌種烘焙性能分析

由表4可知，LBBE-1和LBBE-2酵母菌具有較高的產(chǎn)氣能力，為進一步比較菌種對面包烘焙性能的影響，將2菌株進行了烘焙性能分析，以某商業(yè)酵母作為對照樣本進行感官品評。如圖2所示，與商業(yè)酵母相比，LBBE-1在組織形態(tài)、氣味、口感和貯藏性能分別較商業(yè)酵母提升1.8%、7.7%、7.4%和7.9%，LBBE-2在組織形態(tài)、氣味和口感分別較商業(yè)酵母提升1.8%、13.5%和9.3%，但醒發(fā)時間酵母菌LBBE-1長于商業(yè)酵母30.7%，酵母菌LBBE-2的醒發(fā)時間過長，長于商業(yè)酵母的49.3%，貯藏性能也較低，為商業(yè)酵母的10.5%，因此選擇LBBE-1進行后續(xù)試驗。

a-甜面包感官評價;b-軟歐包感官評價圖2 面包的感官評價Fig.2 Bread sensory evaluation

表4 篩選和馴化菌株的形態(tài)特征及產(chǎn)氣量的比較Table 4 Comparison of morphological characteristics and gas production of screened and domesticated strains

2.3 菌種鑒定

對酵母菌LBBE-1基因組DNA通過ITS通用引物進行PCR擴增，并對產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果與Genbank中酵母菌的18S rDNA序列進行比對，結(jié)果顯示LBBE-1為釀酒酵母。通過NCBI中的BLAST將菌株LBBE-1測定結(jié)果進行同源性比對，與S.cerevisiaeYJM1478具有最高的同源性，為98.32%，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

2.4 菌種高糖、高鹽耐受性分析

由于在甜面包制作過程中，LBBE-1醒發(fā)時間略長，而在軟歐包制作過程中醒發(fā)快，將2個配方進行對比發(fā)現(xiàn)，甜面包制作過程中使用的大量糖、鹽可能導致菌體生長受限，因此首先對LBBE-1的耐糖、耐鹽性能進行測定。由圖4-a得出，在300 g/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基中，LBBE-1適應(yīng)期延長；由圖4-b可知，在含有10 g/L NaCl的高鹽培養(yǎng)基中菌濃為不含 NaCl的0.4倍，在20 g/L NaCl中菌濃為不含NaCl的0.25倍，在300 g/L葡萄糖、20 g/L NaCl的高糖、高鹽培養(yǎng)基中生長趨勢不明顯?？赏茢嗪Y選菌株LBBE-1由于在高糖、高鹽環(huán)境中無法正常生長而導致產(chǎn)氣能力弱，因此可對菌株LBBE-1進行馴化以獲得滿足甜面包制作的菌株。

a-耐糖性能測定;b-耐鹽性能測定圖4 酵母菌LBBE-1耐受性能測定Fig.4 Tolerance of yeast LBBE-1

2.5 菌種耐受性馴化分析及效果測定

首先對LBBE-1進行了耐糖馴化，經(jīng)6 d馴化獲得在含有100 g/L葡萄糖高糖培養(yǎng)基中OD600=6.2的3株菌，接種至含有200 g/L葡萄糖高糖培養(yǎng)基中7 d后獲得OD600=6.3的3株菌，接種至含有300 g/L葡萄糖高糖培養(yǎng)基中7 d后獲得OD600=6.3的3株菌，獲得耐高糖酵母，由圖5-a可知 OD600提升至原始菌株2.2倍。將耐高糖菌株進行高鹽耐受性馴化，由圖5-b可知耐高糖酵母11 d后可在含有10 g/L NaCl高鹽培養(yǎng)基中正常生長、 23 d后可在含有15 g/L NaCl高鹽培養(yǎng)基中正常生長、 34 d后可在含有20 g/L NaCl高糖、高鹽培養(yǎng)基中正常生長，最終獲得在含有300 g/L葡萄糖、20 g/L NaCl高鹽培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定生長的酵母，OD600=6.1，提升至原菌株的8.5倍。對馴化菌株進行保藏，命名為S.cerevisiaeLEEB-1，保藏編號為GDMCC No.60 989。

a-耐糖馴化;b-耐鹽馴化圖5 酵母菌LBBE-1耐受性馴化Fig.5 Tolerant domestication of LBBE-1

為進一步驗證耐受性效果，以某商業(yè)酵母為對照進行感官評定，由圖2可知，馴化株已具有與商業(yè)酵母同等發(fā)酵力，此外甜面包制作組織形態(tài)、氣味、口感和貯藏性能較商業(yè)酵母高出3.5%、7.7%、7.4%和5.3%，與馴化前相比醒發(fā)時長提升44.2%、組織形態(tài)提升1.7%，但貯藏性能下降了2.4%，表現(xiàn)為面包芯失水；與商業(yè)酵母相比軟歐包制作中馴化株在醒發(fā)時間、組織形態(tài)、氣味、口感和貯藏性能分別高出8.7%、5.6%、9.6%、5.4%和5.1%，較馴化前醒發(fā)時間提升1.4%、組織形態(tài)提升3.6%、口感及貯藏性能無差異，但氣味降低了3.4%，表現(xiàn)為老面風味部分減弱。

2.6 菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化

培養(yǎng)條件優(yōu)化包括最適生長接種量、pH、溫度、碳源和氮源的優(yōu)化，其中，碳源的選擇受到菌株馴化條件的影響，最終選擇葡萄糖作為碳源進行濃度優(yōu)化，而氮源則依據(jù)食品生產(chǎn)成本及對菌株風味等的影響，選擇玉米漿和酵母浸粉作為復合氮源。

2.6.1 最適生長溫度

將種子液以10% 接種量接種至YPD培養(yǎng)基中，分別在28、30、32、34、36 ℃下培養(yǎng)24 h，由圖6-a可知當溫度為30 ℃時，酵母菌菌濃最大，OD600=16.4。

2.6.2 最適生長pH

將種子液以10% 接種量分別接種至pH值為6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖6-b所示,當pH為6.8時酵母菌生長有最大菌濃，OD600=17.0，較未優(yōu)化提升至1.04 倍。

2.6.3 最適生長接種量

將種子液分別以1%、4%、7%、10% 、13% 接種量接種至pH值為6.8的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，如圖6-c所示，4%接種量下酵母菌生長最好，OD600=18.6，較未優(yōu)化提升至1.09倍。

2.6.4 最適生長葡萄糖濃度

將種子液以4%接種量分別接種至pH值為6.8，葡萄糖質(zhì)量濃度分別為10、 25、 40、 55、 70 g/L的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，如圖6-d所示，葡萄糖質(zhì)量濃度為55、70 g/L的OD600值無明顯變化，為節(jié)約工業(yè)生產(chǎn)成本選擇55 g/L為最佳培養(yǎng)條件，OD600=22.5，較未優(yōu)化提升至1.21倍。

2.6.5 最適氮源

氮源為質(zhì)量濃度分別為15、 25、 35、 45、 55 g/L的玉米漿、質(zhì)量比5∶1和10∶1的玉米漿∶酵母浸粉，將種子液以4% 接種量接種至pH值為6.8、葡萄糖55 g/L 的培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h測定菌濃，如圖6-e所示，玉米漿和酵母浸粉作為混合氮源使用且比例為5∶1時，酵母菌生長較好，當質(zhì)量濃度為25 g/L時獲得最大菌濃，OD600=30.5，較未優(yōu)化提升至1.4倍。

2.6.6 生長曲線測定

在最佳培養(yǎng)條件下，每2 h測定1次菌濃。生長曲線圖6-f，S.cerevisiaeLBBE-1生長20 h達到穩(wěn)定，OD600=30.2，較未優(yōu)化提升至1.8倍。

a-溫度對酵母菌生長的影響;b-pH對酵母菌生長的影響;c-接種比例對酵母菌生長的影響;d-葡萄糖對酵母菌生長的影響;e-氮源對酵母菌生長的影響;f-酵母菌生長曲線圖6 不同培養(yǎng)條件對酵母菌S.cerevisiae LBBE-1生長的影響Fig.6 Effects of different culture conditions on the growth of S.cerevisiae LBBE-1

2.7 菌種放大培養(yǎng)條件優(yōu)化

15 L發(fā)酵罐以60%裝液量、以1∶1通氣比、220 r/min 轉(zhuǎn)速進行恒溫培養(yǎng)，將優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基初始葡萄糖質(zhì)量濃度提升至 221.6 g/L，測定發(fā)酵過程中葡萄糖變化情況，如圖7-a所示，耗糖速率0～2 h、2～4 h、4～7 h、8～12 h、12～16 h、16～20 h分別為1.6、 4、 5.3、 13.9、 17.2、 10.8 g/(L·h)，于20 h獲得最大菌濃，OD600=58。

由圖7-b可知，當對發(fā)酵體系的溫度及pH進行控制時，菌濃OD600=68.7，在此基礎(chǔ)上進行溶氧關(guān)聯(lián)調(diào)控時，菌濃達74.5，以4.5 g/(L·h)進行恒速流加時，菌濃為83.4，以圖7-a中糖耗進行擬合流加，由于前期試驗中發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)生長期之后補料會導致葡萄糖被利用于呼吸代謝而非生長，因此選擇葡萄糖補加策略為0～2 h-5 g/(L·h)、2～4 h-10 g/(L·h)、4～8 h-15 g/(L·h)，酵母菌生長獲得最大菌濃，OD600=92.9，將發(fā)酵液進行稀釋，取10 μL點加至YPD固體培養(yǎng)基上，取3次測定的平均值，最終測定活菌數(shù)為6.3×109CFU/mL。

a-耗糖曲線;b-不同控制策略圖7 不同調(diào)控方式對酵母菌S.cerevisiae LBBE-1生長的影響Fig.7 Different control on S.cerevisiae LBBE-1 fermentation

3 結(jié)論

為了解決天然酵母在使用過程中存在的醒發(fā)時間長及生產(chǎn)應(yīng)用的問題，本研究以天然葡萄發(fā)酵液為樣本篩選獲得了一種能夠提升烘焙品質(zhì)的天然酵母中的烘焙酵母LBBE-1，經(jīng)耐受性馴化，菌種在300 g/L葡萄糖條件下菌濃提升至原始菌種的2.2倍， 300 g/L葡萄糖、20 g/L NaCl條件下菌濃提升至8.5倍。經(jīng)烘焙效果驗證發(fā)現(xiàn)其已具有與商業(yè)酵母同等的醒發(fā)能力，且在組織結(jié)構(gòu)、氣味、口感、貯存性能評分更高。為了進一步達到工業(yè)生產(chǎn)條件，對其進行了發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以4%的接種量接種至55 g/L葡萄糖、21 g/L玉米漿、4 g/L酵母浸粉、pH 6.8的培養(yǎng)基中，30 ℃、溶氧轉(zhuǎn)速偶聯(lián)(220～600 r/min)、葡萄糖擬合流加培養(yǎng)22 h可獲得最大菌濃OD600值為92.9，活菌數(shù)為6.3×109CFU/mL。上述研究為天然酵母的高效篩選、性能強化及在烘焙行業(yè)的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。