鄭波 戴芳芳 郭影 郭鈺英 劉彥民

近年來，IVF-ET 助孕技術(shù)，已經(jīng)成為治療不孕癥的主要方法之一。使用促性腺激素釋放激素激動 劑 （gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）的降調(diào)方案仍是IVF-ET 助孕過程中經(jīng)典的促排卵方案，GnRH-a 可能帶來的是內(nèi)源性促黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）非生理性過低，從而表現(xiàn)為Gn 使用劑量增加和使用時間延長，成熟卵泡數(shù)目減少，卵子質(zhì)量下降等。目前研究支持在垂體降調(diào)節(jié)超促排卵方案中添加外源性促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）具潛在有利作用。促排卵常用藥物有r-LH和HMG，HMG中含有LH 及人絨毛膜促性腺激素（hCG）驅(qū)動LH 活性。本文旨在對比和研究IVF-ET 助孕過程中hCG扳機日因注射HMG 造成血中β-hCG 水平升高與否，與妊娠結(jié)局及活產(chǎn)率的關(guān)系，以期進(jìn)一步指導(dǎo)臨床工作。

資料和方法

一、研究對象及分組

1.研究對象

選擇2016 年1 月到2017 年12 月于邢臺市生殖醫(yī)學(xué)中心（邢臺不孕不育?？漆t(yī)院）采用長效達(dá)菲林長方案治療的IVF-ET患者710例。納入標(biāo)準(zhǔn)：黃體期長效GnRH-a長方案降調(diào)節(jié)、首次接受IVF-ET治療、新鮮卵裂期胚胎移植。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、子宮畸形、盆腔結(jié)核史、宮腔粘連史、頑固多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrom，PCOS）、卵巢功能減退者（AFc＜5 個、AMH ＜0.5～1 ng/mL、月經(jīng)第2～4 天FsH ＞10 u/L）、染色體異?；颊?、排除治療前三個月有激素治療史者；（2）患有影響妊娠過程的相關(guān)疾病，如：糖尿病、高血壓、免疫系統(tǒng)疾病；（3）既往不良孕產(chǎn)史患者，如：胎兒生長受限、前置胎盤、胎盤早剝、先兆子癇。

2.分組

超促排卵中晚期添加HMG 為A 組，根據(jù)hCG日血β-hCG 水平，分為β-hCG ≥1 mIU/mL（A1組，81 例）和β-hCG ＜1 mIU/mL 組（A2 組，355例）；超促排卵期間應(yīng)用r-LH（FSH）（B 組，274例）。對A1、A2組及A2、B組，A1、B組助孕參數(shù)及妊娠結(jié)局、活產(chǎn)率進(jìn)行兩兩比較。

二、研究方法

1.治療方案

按本中心常規(guī)黃體中期肌肉注射GnRH-a（注射用醋酸曲普瑞林，3.75 mg，博福-益普生）1.25～1.5 mg 降調(diào)節(jié)14～16 d，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)，即性激素FSH、LH均≤5 U/L、E2≤183.50 pmol/L、P＜2.54 nmol/L、β-hCG＜1.00 mIU/mL，超聲顯示雙側(cè)卵巢內(nèi)卵泡平均直徑≤5 mm，開始給予重組卵泡刺激素（普麗康注射液，100 IU，默沙東）、和/或HMG（注射用尿促性素，麗珠制藥），和/或r-LH（注射用重組人促黃體激素α，75 IU，Merck Serono SA）促排卵，陰道超聲檢查監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，并結(jié)合雌孕激素水平調(diào)整促排卵藥物劑量；當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm 或至少2枚卵泡直徑≥17 mm 或3 枚卵泡直徑≥16 mm 時，抽血檢查血β-hCG、LH、E2、P，當(dāng)晚給予人絨毛膜促性腺激素（注射用絨促性素，珠海麗珠）5 000～10 000 U肌注。

2.取卵及胚胎移植

注射hCG后36～37 h陰道超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，IVF/ICSI 受精。卵母細(xì)胞受精第3 天，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植，患者年齡＜35歲最多移植2枚胚胎，≥35歲最多移植3枚胚胎。剩余胚胎冷凍。移植后常規(guī)黃體支持：每次黃體酮軟膠囊200 mg，日3次陰道上藥。移植后14 d 查尿或血β-hCG，陽性者繼續(xù)黃體支持。胚胎移植后第4周經(jīng)陰道超聲檢測有孕囊和胎心搏動者，確定為臨床妊娠，妊娠12 周之前的妊娠丟失，確定為早期流產(chǎn)。助孕過程中密切監(jiān)測助孕并發(fā)癥卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS） 的 發(fā) 生 情況，其分類指標(biāo)參考《臨床診療指南-輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊》［1］。經(jīng)隨訪到分娩確認(rèn)有活嬰兒分娩，活產(chǎn)周期/移植周期統(tǒng)計活產(chǎn)率。

三、檢測指標(biāo)

記錄A、B 組患者的年齡、不孕年限、身體質(zhì)量指數(shù)（Body Mass Index，BMI）、bFSH、AMH、HMG用量、hCG日血E2、hCG日血P、hCG日血βhCG、內(nèi)膜厚度、Gn天數(shù)、獲卵數(shù)、ICSI周期M Ⅱ卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、臨床妊娠率、胚胎著床率、早期流產(chǎn)率、多胎率、中重度OHSS發(fā)生率、活產(chǎn)率。

四、性激素測定及方法

在長方案降調(diào)后不同時點留取患者血清樣本測定性激素：Gn 啟動日測基礎(chǔ)性激素（FSH、LH、E2、P、β-hCG）；注射hCG 日測性激素（LH、E2、P、β-hCG）。性激素檢測使用儀器和試劑為德國西門子全自動化學(xué)發(fā)光儀和配套試劑，質(zhì)控品均采用伯樂質(zhì)控品。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較進(jìn)行正態(tài)分布檢測，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用one-way ANOVA方差分析；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，采用χ2檢驗及Fisher 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

A1 組、A2 組、B 組三組比較不孕年限、BMI、bFSH、AMH 值，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），年齡A1組高于其他兩組，比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

二、A1 組、A2 組、B 組三組促排卵參數(shù)及妊娠結(jié)局的比較

Gn 天數(shù)A2 組最高，與其他兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A1與B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Gn 用量B 組最低，其次為A2、A1組，三組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；患者HMG 用量A1 組大于A2 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；hCG 日E2水平、總獲卵數(shù)三組比較，A2 組最高，A1 組最低，三組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ICSI 周期MⅡ卵率三組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中A1組與A2組，A2與B組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中重度OHSS 發(fā)生率A1 組、A2 組均較高，與B 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A1、A2 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；hCG 日P 水平、內(nèi)膜厚度、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、多胎率、臨床妊娠率、著床率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 三組患者一般情況比較（±s）

表1 三組患者一般情況比較（±s）

注：*A1與A2相比，P＜0.05.

組別A1組A2組B 組P值F值A(chǔ)MH（ng/mL）4.13±3.18 3.90±2.19 3.65±2.16 0.19 1.63例數(shù)81 355 274年齡（歲）31.70±4.91*29.74±4.64 29.80±4.08 0.02 4.11不孕年限（年）4.04±3.18 4.30±3.17 3.96±2.859 0.16 1.78 bFSH（U/L）5.96±2.08 6.41±1.77 6.49±2.02 0.47 0.75 BMI（kg/m2）23.39±3.43 23.77±3.26 23.17±3.03 0.51 0.66

表2 三組間促排卵參數(shù)及妊娠結(jié)局的比較［（±s），n（%）］

表2 三組間促排卵參數(shù)及妊娠結(jié)局的比較［（±s），n（%）］

注：*A1組與A2組比較，P＜0.05；**A1組與B組比較，P＜0.05；***A2組與B組比較，P＜0.05。

組別A1組A2組B組P值F/χ2值例數(shù)81 355 274 Gn天數(shù)（d）11.67±1.77*12.13±1.90 11.52±1.39***0.00 10.24 Gn用量（IU）2601.39±728.88*2483.16±762.64**2251.47±605.10***0.00 86.69 HMG量（支）15.20±13.58*6.23±6.26**0***0.00 3574.48 HCG日E2（pmol/L）11069.42±8710.71*15309.33 ± 8937.94**13244.26±6755.59***0.00 10.92 HCG日P（nmol/L）2.74±1.23 3.13±1.58 2.97±1.32 0.67 2.71 hCG日內(nèi)膜（mm）11.62±2.45 11.49±2.41 11.51±2.21 0.83 0.19總卵數(shù)（枚）10.70±6.05*14.84±6.79**13.03±5.41***0.00 17.02 ICSI周期MⅡ卵率86.67%（117/135）*76.36%（1 182/1548）80.18%（700/873）***0.01 5.24組別A1組A2組B組P值F/χ2值活產(chǎn)率（%）36/57（63.16%）125/234（53.42%）112/202（55.45%）0.42 1.76例數(shù)81 355 274優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚）2.15±2.19 2.63±2.31 2.42±2.41 0.19 1.65臨床妊娠率（%）39/57（68.42%）146/234（62.39%）129/202（63.86%）0.70 0.72著床率（%）56/120（46.67%）215/483（44.51%）173/408（42.40%）0.66 0.98中重度OHSS發(fā)生率（%）11.11%（9/81）7.34%**（26/354）2.93%（8/273）***0.01 9.33早期流產(chǎn)率（%）3/39（7.69%）14/146（9.59%）14/129（10.85%）0.84 0.36多胎率（%）17/39（43.58%）65/146（44.5%）45/129（34.88%）0.24 2.82

討 論

基于“兩促性腺兩細(xì)胞學(xué)說”，F(xiàn)SH 與LH 的協(xié)同作用在卵泡正常發(fā)育過程中起著非常重要的作用［2-3］。而在IVF-ET 治療過程中，GnRH-a 對垂體的降調(diào)節(jié)，除可以抑制內(nèi)源性LH 峰、避免卵泡黃素化及早排卵以外，還可對LH 產(chǎn)生過度抑制，導(dǎo)致雄激素底物缺乏，使雌激素水平下降、延遲卵母細(xì)胞成熟時間、卵子質(zhì)量下降、Gn 天數(shù)延長、Gn用量加大，雖然獲卵數(shù)多而體內(nèi)雌孕激素水平相對減少，影響IVF-ET 妊娠結(jié)局［4-5］。尤其在超促排卵中后期，LH 的作用尤為重要，2014 年的Meta 分析［6］顯示，與單獨rFSH 促排卵相比，rLH 添加能顯著增加獲卵數(shù)和臨床妊娠率。Pezzuto A 等［7］在垂體降調(diào)節(jié)方案超促排卵過程中添加外源性LH 制劑，較未添加患者無論是實驗室結(jié)局和妊娠結(jié)局均有明顯的改善。因此，臨床上尤其是GnRH-a 降調(diào)節(jié)方案，多采用FSH制劑聯(lián)合LH制劑應(yīng)用。

目前，臨床上含有LH 制劑有r-LH 以及HMG，部分報道應(yīng)用hCG制劑代替LH的作用［8-10］，原因為hCG 在分子結(jié)構(gòu)上與LH 具有相同的α-亞單位，相同的hCG/LH 受體，并且由于β-亞單位不同，hCG具有特異的生物學(xué)活性，半衰期更長、與受體的親和力更強，其不僅僅是與妊娠密切相關(guān)的激素，它還可以參與女性的生殖調(diào)控［11］。HMG 是最早的尿源性制劑，其內(nèi)含有等量的FSH和LH，其中LH的活性僅為FSH的三分之一，所以制劑添加了hCG成分，使FSH：LH活性比為1∶1［12］。

關(guān)于促排卵過程中血清β-hCG 水平對促排卵及妊娠結(jié)局的影響，有研究認(rèn)為［13］，長方案中促排卵第6日血清β-hCG水平與患者優(yōu)質(zhì)胚胎比例成正相關(guān)，且β-hCG 水平最高組患者有最高的繼續(xù)妊娠率。另外，因hCG半衰期明顯高于LH，為LH的6～8倍，生物活性也高出2～3倍［8］，其升高是否對妊娠有不利的影響，有報道認(rèn)為雖然超促排卵過程中升高的LH對妊娠率有不利影響，但內(nèi)源性LH升高與外源性補充的LH 具有完全不同的意義［14］。但也有不同的觀點，有報道認(rèn)為添加hCG 對Gn 用量、成熟卵子數(shù)、＜40 歲患者的受精數(shù)、冷凍胚胎數(shù)、獲取每個成熟卵子的費用方面均沒有觀察到優(yōu)勢，還可能因hCG 半衰期長，導(dǎo)致LH 活性累積，達(dá)到或超過LH 需要量的上限，而影響卵子及胚胎的質(zhì)量［15-17］。

本研究中，采用長效GnRHa長方案促排卵，均為r-FSH 聯(lián)合HMG 或r-LH方案，根據(jù)卵泡生長速度、E2上升情況、LH、P 水平調(diào)整r-FSH 及r-LH/HMG 的用量。通過促排卵最后一日即hCG 注射日血清β-hCG 水平的不同分組，結(jié)果顯示應(yīng)用r-LH組（B 組）患者均無β-hCG 的升高；應(yīng)用HMG 的A1 組和A2 組，hCG 注射日血清β-hCG 較高的A1組患者年齡明顯增高，HMG 用量明顯高于未升高組（A2組、B組），說明β-hCG的升高與HMG的用量相關(guān)，用量越大，血中的β-hCG水平越高。

hCG 日E2水平及獲卵數(shù)，A2 組最高，A1 組最低，三組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這與Gn的用量不成比例，Gn用量方面，A1組是最高的，B組最低，進(jìn)一步顯示基因重組FSH 及LH 較尿源性HMG 純度高、生物活性更強，此結(jié)論與多家文獻(xiàn)報道一致［18-19］，且不排除HMG 用量較大致Gn 活性不穩(wěn)定可能，造成部分卵泡閉鎖，顆粒細(xì)胞功能受到不同程度的影響；另外其內(nèi)含有的相對較高的hCG成分用于控制性超促排卵，可減少排卵前小卵泡的數(shù)量使得卵泡數(shù)減少［20］。

值得關(guān)注的是，三組患者發(fā)生中重度OHSS 的比例，排除患者自身因素（年輕、低BMI、PCOS等）及促排卵方案、妊娠等影響因素，并不完全符合通常所認(rèn)知的OHSS 發(fā)生主要與獲卵數(shù)、hCG 日雌二醇水平有關(guān)的規(guī)律［1］。A1 組其年齡三組最高，BMI、妊娠率、多胎率、促排卵方案均無特殊易感因素的前提下，其獲卵數(shù)、hCG 日E2水平三組最低，而OHSS 發(fā)生率最高。原因可能為A1 組應(yīng)用HMG 量最大，HMG 的藥物成分，由于制藥工藝的局限性，其成分的95%為尿雜質(zhì)蛋白，而Gn 僅占5%［21］，較多的尿雜質(zhì)可能引發(fā)機體內(nèi)部的變態(tài)反應(yīng)，而內(nèi)源性免疫系統(tǒng)高反應(yīng)性與OHSS 發(fā)生有關(guān)［1］。另外血中β-hCG 的升高可以誘發(fā)及加重OHSS的發(fā)生，但本研究中因注射HMG輕度升高的血β-hCG是否是其因素之一，須進(jìn)一步研究證明。

關(guān)于Gn時間的延長及排卵（取卵）前P水平的升高，研究的較多，IVF助孕周期中，使用GnRH-a降調(diào)節(jié)，可導(dǎo)致內(nèi)源性LH 或其活性不足而造成卵泡生長慢，需要增加和/或延長FSH 刺激，以維持和完成卵泡發(fā)育［22-24］。外周血孕酮水平直接與大量卵泡及外源性FSH有關(guān)，其中卵泡增多是孕酮升高的主要原因［25］，此外，孕酮水平升高還與卵泡期延長或雌二醇（E2）水平升高相關(guān)［26］。另外，經(jīng)典的兩細(xì)胞-兩促性腺激素學(xué)說進(jìn)一步說明排卵前一定量的LH，是維持膽固醇以△4代謝途徑為主的關(guān)鍵激素之一［27-28］，如LH 的不足可能讓排卵前期膽固醇代謝過多的走向△5途徑，從而引起血中P水平的升高。本研究顯示的A2組有最高的Gn天數(shù)、且其hCG日P水平最高，考慮與其LH不足及高的卵泡數(shù)（獲卵數(shù)）、Gn 用量有關(guān)。另外，A1 組hCG 日P 水平最低，進(jìn)一步說明HMG 促排卵使得β-hCG 的升高能夠很好地補充血中的LH 活性，這與潘萍等［11］，Ezcurra D等［29］研究觀點一致。

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是卵子取出后4～6 小時拆除顆粒細(xì)胞同時觀察卵子成熟度，較IVF 技術(shù)可以更好地反應(yīng)MII 卵的情況，方法為MII 卵母細(xì)胞總數(shù)/ICSI 獲卵數(shù)×100%，也是反應(yīng)COS的重要指標(biāo)之一，其可能與降調(diào)時間、劑量、啟動Gn 時間、卵巢反應(yīng)、扳機時機、取卵者的經(jīng)驗等有關(guān)［30］。較多文獻(xiàn)報道，通過COH 所募集的卵母細(xì)胞中大約有15%為未成熟的卵母細(xì)胞［31-32］，這些未成熟的卵母細(xì)胞主要源自COH過程中的小卵泡，對藥物有高反應(yīng)的患者經(jīng)常產(chǎn)生更多的未成熟卵子［33］。本研究中A2 組ICSI 周期MⅡ卵率低于其他兩組，因本中心取卵手術(shù)人員及扳機把控人員均為固定人員，且均具有多年的臨床經(jīng)驗，可排除相關(guān)因素影響，而從卵巢反應(yīng)性來說，A2 組獲卵數(shù)、hCG 日E2水平、OHSS 的發(fā)生率均較高，因此可能存在較多的小卵泡生長，獲得的MⅡ卵子率相對下降。但其優(yōu)質(zhì)胚胎個數(shù)與其他組比較無差異，進(jìn)一步說明，MⅡ卵率的下降并未下降其優(yōu)質(zhì)卵子及胚胎的數(shù)量。

雖然三組在助孕的各項數(shù)據(jù)中存在差異，但在子宮內(nèi)膜厚度及助孕結(jié)局方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明降調(diào)節(jié)超促排卵過程中無論是r-LH 或hCG 成分補充，均可達(dá)到較滿意的妊娠結(jié)局。而三組中A1 組患者的年齡高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，年齡作為生育力評估的重要因素，可作為影響妊娠結(jié)局的獨立因素［34］，因此，進(jìn)一步說明血清中β-hCG水平的輕度升高，并未對卵泡顆粒細(xì)胞黃素化、內(nèi)膜的容受性及胚胎的著床、發(fā)育產(chǎn)生不良的影響。在活產(chǎn)率方面，雖然A1 組最高，但是由于數(shù)據(jù)較少需要進(jìn)一步擴大數(shù)據(jù)觀察才能得出結(jié)論?？紤]到輔助生殖助孕的特殊性角度，具有一定的臨床意義，值得進(jìn)一步研究。

輔助生殖技術(shù)最理想的狀態(tài)是減少并發(fā)癥及不良反應(yīng)，達(dá)到最好的妊娠及活產(chǎn)結(jié)局。hCG 日βhCG 的升高與應(yīng)用HMG 的量有關(guān)，基因重組Gn 較尿源性Gn 純度高、生物活性更強。hCG 日β-hCG的升高時助孕結(jié)局較好，費用低廉，但其可能增加OHSS的發(fā)生率、增加Gn用量。臨床醫(yī)生須進(jìn)一步分析不同藥物的特點等等，達(dá)到個體化治療的目的。