潘 赟， 劉世榮，易曉華，張 宇，孫秀柱，2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，精液冷凍保存研究在動(dòng)物生產(chǎn)繁殖領(lǐng)域方面也受到高度重視，然而精子在冷凍保存過(guò)程中會(huì)受到不同程度的損傷，如：物理?yè)p傷，化學(xué)損傷和氧化應(yīng)激損傷。其中，氧化應(yīng)激損傷是降溫保存過(guò)程中損害精子的主要因素，對(duì)精子結(jié)構(gòu)形態(tài)會(huì)產(chǎn)生一系列的不利影響，包括細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成、脂質(zhì)相變以及質(zhì)膜重組引起的膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，造成冷凍復(fù)蘇后精液品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。家畜精子對(duì)低溫尤為敏感，冷凍解凍后精子活力一般不超過(guò)50%[1]。在山羊精液冷凍保存過(guò)程中，由于精子質(zhì)膜中含有大量的不多飽和脂肪酸，使山羊精液在冷凍保存期間極易受到氧化應(yīng)激損傷影響，活性氧的過(guò)量產(chǎn)生使精子細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御平衡體系遭到破壞[2]，進(jìn)而造成精子質(zhì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，影響精子的運(yùn)動(dòng)性、代謝及細(xì)胞內(nèi)成分的高滲漏率，破壞精子頂體、質(zhì)膜及DNA的完整性。在實(shí)踐應(yīng)用中，添加外源性抗氧化劑可以減少精子細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷影響，降低ROS及過(guò)氧化水平，提高精子品質(zhì)及母畜授胎率。為此，本文以活性氧的產(chǎn)生及對(duì)精液冷凍保存損傷機(jī)理和常用抗氧化劑對(duì)山羊精液冷凍保存的作用兩方面進(jìn)行綜述，期望為山羊精液冷凍保存相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 活性氧對(duì)山羊精液冷凍保存的影響

活性氧(Active Oxygen , ROS)是生物體內(nèi)正常有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列副產(chǎn)物，由于核外含有不成對(duì)電子,它們能夠形成高活性分子，在與電子反應(yīng)時(shí)，氧轉(zhuǎn)化為活性氧物質(zhì)，主要包括超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)、一氧化氮(NO)等[3]。精子細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生主要是由線粒體呼吸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH氧化酶)、脂氧合酶等酶類產(chǎn)生。此外，在冷凍解凍過(guò)程中受滲透壓、冷休克、高度稀釋等因素刺激，也會(huì)產(chǎn)生大量ROS。ROS在動(dòng)植物體內(nèi)具有雙重意義，在許多重要信號(hào)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[4]，但ROS也是有氧代謝的有毒副產(chǎn)物[5]。有研究報(bào)道，在精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能成熟的生理過(guò)程中，適量ROS的產(chǎn)生對(duì)精子細(xì)胞的成熟，誘發(fā)精子超激活運(yùn)動(dòng)及精子獲能發(fā)揮著積極作用[6]，此外，適量的ROS還能提高酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。但ROS水平較高時(shí)，精子細(xì)胞易受氧化應(yīng)激損傷影響，導(dǎo)致細(xì)胞自身抗氧化防御機(jī)制受到破壞，失去自我保護(hù)功能，對(duì)精子細(xì)胞的存活構(gòu)成嚴(yán)重威脅。ROS對(duì)精子的作用模式主要有三種:①脂質(zhì)過(guò)氧化，是ROS影響精子功能的主要方式。它可以將細(xì)胞膜內(nèi)多不飽和脂肪酸過(guò)氧化，產(chǎn)生丙二醛，影響精子質(zhì)膜的完整性[7]；②對(duì)線粒體 ATP 產(chǎn)生發(fā)生影響，ROS可以降低軸絲蛋白磷酸化，影響精子的運(yùn)動(dòng)能力；③誘導(dǎo)精子DNA損傷，堿基修飾、移碼突變及染色體重排[8]，改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增加細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致精卵結(jié)合受損[9]。此外，ROS對(duì)胚胎發(fā)育、流產(chǎn)和不育也有著密切的聯(lián)系[10]。

2 抗氧化劑對(duì)精液冷凍保存的影響

動(dòng)物生殖組織中存在自身的氧化還原平衡體系，當(dāng)受到ROS刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)抗氧化機(jī)制會(huì)被啟動(dòng)，以減輕自身氧化損傷程度。有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的精子可以通過(guò)糖酵解、三羧酸循環(huán)結(jié)合磷酸戊糖或糖酵解結(jié)合線粒體三羧酸循環(huán)途徑獲得能量，使精子產(chǎn)生氧化還原能力[11]。但在精液冷凍保存過(guò)程中，ROS的過(guò)量產(chǎn)生與精子抗氧化活性之間的氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)受到破壞，精子質(zhì)量受到嚴(yán)重?fù)p害。因此，添加外源性抗氧化劑是抵抗自由基誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的主要防御因子[12]，通過(guò)阻止自由基鏈的生成和蔓延來(lái)減少氧化應(yīng)激造成的損傷，以維持自身抗氧化平衡，提高凍融后精子質(zhì)量。

常見(jiàn)的抗氧化劑主要有酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，酶類抗氧化劑也稱為天然抗氧化劑，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、輔酶Q10等。非酶類抗氧化劑也稱為合成抗氧化劑，主要包括維生素類(VE、VC)、氨基酸類(半胱氨酸、谷氨酰胺)、多糖類(海帶多糖、枸杞多糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等)及其他抗氧化劑(褪黑素、谷胱甘肽)。這些抗氧化劑均能中和精液中過(guò)多的ROS，降低氧化應(yīng)激損傷水平，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改善冷凍解凍后精子品質(zhì)(見(jiàn)表1～2)。

表1 酶類抗氧化劑的作用及機(jī)制Table 1 Action and mechanism of enzymatic antioxidants

表2 非酶類抗氧化的分類及作用機(jī)制Table 2 Classification and mechanism of non-enzymatic antioxidants

2.1 酶類抗氧化劑對(duì)山羊精液冷凍保存的影響

酶類抗氧化劑也稱為天然抗氧化劑，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)是精漿中ROS主的清除劑, 對(duì)精子發(fā)生和維持精子的正常受精能力具有積極作用，SOD廣泛存在于生物體內(nèi)，是一種源于生命體的活性金屬酶物質(zhì)，被認(rèn)為是抵抗活性氧的第一道防線，在冷凍保存中能有效減少自由基產(chǎn)生，保護(hù)超氧陰離子自由基對(duì)機(jī)體的損害；CAT也叫接觸酶酵，可以減弱或消除H2O2對(duì)細(xì)胞的毒害作用；輔酶 Q10(Coenzyme Q10，Co Q10)屬脂溶性抗氧化劑，主要存在于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上,是氧化磷酸化反應(yīng)過(guò)程中多種酶的輔酶；此外，輔酶 Q10具有增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞、抗細(xì)胞凋亡等作用。劉超等[24]研究表明，山羊精液中GSH-Px、SOD活性與精子活力呈極顯著正相關(guān)。Berlingue等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中添加SOD能顯著提高精子活力，同對(duì)照組相比在含有SOD組中，在3 h、6 h和9 h精子活力均得到顯著提高，且母畜授精率明顯高于空白組?；裘鬧26]在研究絨山羊精液冷凍保護(hù)中發(fā)現(xiàn)，添加外源性CAT可以顯著提高精子質(zhì)量，當(dāng)添加200 U/mL CAT時(shí)能顯著提高精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率；當(dāng)添加300 U/mL CAT時(shí)，能顯著提高精子活率、DNA 完整率、線粒體膜電位并降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。霍敏等[27]在絨山羊精液冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加輔酶Q10可以提高凍融后精子質(zhì)量, 其中, 添加40 μg/mL輔酶Q10效果最好。

2.2 非酶類抗氧化劑對(duì)山羊精液冷凍保存的影響

2.2.1 維生素類抗氧化劑對(duì)山羊精液冷凍保存的影響 維生素E(Vitamin E，VE)又名α-生育酚，屬于多酚類脂溶性維生素，主要存在于細(xì)胞膜中并能與膜結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)結(jié)合，使膜脂肪酸鏈與ROS之間共價(jià)鍵斷裂，保護(hù)細(xì)胞中不飽和脂肪酸免受氧化反應(yīng)損傷，是機(jī)體重要的抗氧化劑。Azawi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在Tris稀釋劑中添加VC或VE可以顯著提高山羊精子的保存時(shí)間和質(zhì)量，在添加VC或VE5 ℃保存12h后精子活率分別為54.7%和45.5%，異常精子和頂體缺陷率分別為18.8%和52.8%。Kargar等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加VE可以提高冷凍解凍后精子的活力和質(zhì)膜的完整性。施力光等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加VE有助于提高熱帶地區(qū)夏季高溫季節(jié)山羊精子密度、活力，降低畸形率同時(shí)還能增強(qiáng)精漿中抗氧化酶的活性，緩解熱應(yīng)激。Yue等[31]研究發(fā)現(xiàn)，VE可以改善睪丸細(xì)胞膜和線粒體的抗氧化能力，提高精液質(zhì)量；當(dāng)添加200 IU VE 時(shí)對(duì)提高精液質(zhì)量具有積極作用，可以顯著降低MDA水平并改善睪丸細(xì)胞中SOD、GSH-PX活性，提高質(zhì)膜和線粒體的完整性。

維生素C(Vitamin C，VC)又稱抗壞血酸，屬于水溶性維生素，它可以與機(jī)體內(nèi)的自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，能有效地清除機(jī)體內(nèi)多余的ROS及有害自由基。陳宗明等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫保存精液稀釋液中添加 3.0 mg/mL VC可以減少低溫對(duì)精子的損傷，顯著提高精子活力改善精液品質(zhì)。宋天增等[33]研究發(fā)現(xiàn)，添加2.0 mg/mL VC可以降低4 ℃保存藏西北絨山羊精液全基因組DNA甲基化異常水平, 提高藏西北絨山羊精液冷藏效果。Memon等[34]研究不同冷卻速度和冷凍方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，VC能夠改善精液冷凍解凍后精子質(zhì)量，當(dāng)添加8.5 mg/mL VC能改善精子活力、膜和頂體的完整性。

2.2.2 氨基酸類抗氧化劑對(duì)山羊精液冷凍保存的影響 半胱氨酸是一種含巰基的非必需天然氨基酸，是谷胱甘肽的重要合成物，具有抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加半胱氨酸能夠顯著提高精液品質(zhì)降低精子畸形率，但對(duì)質(zhì)膜完整率并沒(méi)有顯著影響，當(dāng)添加5.0 mmol/L的半胱氨酸可以提高精液品質(zhì)和精漿中抗氧化酶的活性[35]；在Tris-卵黃甘油稀釋液中添加半胱氨酸能降低精子脂質(zhì)過(guò)氧化水平，提高母畜妊娠率[36]。但Salvador等[37]研究表明，5 ℃保存山羊精液時(shí)，在稀釋液中添加半胱氨酸并不能提高精子活力。因此，添加半胱氨酸作為冷凍精子抗氧化劑有待商榷。

谷氨酰胺是哺乳動(dòng)物機(jī)體組織中最豐富的一種游離氨基酸，具有改善機(jī)體氮平衡、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為其他氨基酸、核酸的合成提供氮源的作用。此外，谷氨酰胺還能調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，參與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氧化還原活性[38]。研究表明，谷氨酰胺在山羊精子凍融過(guò)程中具有低溫保護(hù)作用，谷氨酰胺的最佳濃度為25 Mm[39]。石薇等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在添加10 mmol/L棉子糖的稀釋液中, 當(dāng)添加5 mmol/L谷氨酰胺時(shí)，能顯著降低冷凍解凍后精子的畸形率，提高精子頂體的完整率和活率。張少華等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加5.0 mmol/L的谷氨酰胺對(duì)冷凍精液品質(zhì)的保護(hù)效果最好。

2.2.3 多糖類抗氧化劑對(duì)山羊精液冷凍保存的影響 多糖類抗氧化劑是由單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的化合物，屬于非滲透性保護(hù)劑具有抗氧化性。此外，在冷凍保存過(guò)程中，糖類抗氧化劑還可以作為能量物質(zhì)，為線粒體氧化磷酸化提供能量，提高過(guò)氧化酶的活性。王艷華[43]在山羊精液冷凍稀釋液中分別添加1.0 mg/mL 海帶多糖和4.0 mg/mL枸杞多糖，能有效提高凍融后山羊精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率和線粒體活性；在基礎(chǔ)液中配伍添加海帶多糖和枸杞多糖也能夠有效改善冷凍解凍后山羊精子活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率，其最佳配伍濃度為 1.0 mg/mL 海帶多糖+2.0 mg/mL 枸杞多糖。孟克格日樂(lè)[44]在內(nèi)蒙古白絨山羊精液冷凍稀釋液研究中發(fā)現(xiàn)，在山羊精液冷凍稀釋液里添加海藻糖能有效提高冷凍解凍后精液品質(zhì)，最佳濃度為0.018 g/mL。任發(fā)等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在絨山羊精液冷凍保存液中分別添加4.0 mg/mL 枸杞多糖和1.0 mg/mL 海帶多糖，冷凍解凍后能提高精子內(nèi)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性；與單獨(dú)添加枸杞多糖或海帶多糖相比，配伍添加2.0 mg/mL枸杞多糖+1.0 mg/mL海帶多糖也能降低精子內(nèi)ROS水平，提高精子質(zhì)量。席利萌等[46]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖對(duì)山羊精液冷凍保存具有較好的冷凍保護(hù)效果, 能明顯提高山羊精液冷凍解凍后精子活率、頂體完整率及GSH水平,降低丙二醛濃度,最適濃度為16 mg/L。

2.2.4 其他抗氧化劑對(duì)山羊精液冷凍保存的影響 褪黑素(Melatonin, MLT) 是一種胺類激素，具有良好的脂溶性和水溶性，色氨酸是合成褪黑素的主要成分，具有刺激抗氧化酶(如GSH-PX和SOD)活性的作用[46]，可以穿透膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞器發(fā)揮其強(qiáng)大的抗氧化功能?；裘舻萚69]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加褪黑素能夠顯著降低絨山羊精子細(xì)胞中ROS的含量, 當(dāng)在稀釋液中添加0.500 mg/mL的褪黑素試驗(yàn)組精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率(53.3%、44.6%和77.9%)均顯著高于空白對(duì)照組 (47.8%、36.3%和53.2%)。Ramadan等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在繁殖季節(jié)褪黑激素可以顯著增加精子的運(yùn)動(dòng)性、射精量、血液睪丸激素濃度，而在非繁殖季節(jié)，褪黑激素能有效減少死精子百分比。

谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是細(xì)胞內(nèi)主要的非蛋白硫醇化合物，可與自由基結(jié)合發(fā)揮自由基清除劑的作用。研究表明，添加GSH可以減少冷凍解凍后精子中ROS的產(chǎn)生，提高精子的運(yùn)動(dòng)性及頂體的完整性[49]；在Tris冷凍稀釋液中添加5 mM的GSH可提高解凍后精子活力，降低頂體異常百分比[50]；在GSH對(duì)綿羊細(xì)管凍精質(zhì)量影響中發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖冷凍稀釋液中添加GSH可以增加冷凍解凍后精子的活力、質(zhì)膜、頂體膜及DNA的完整性,當(dāng)添加1 mmol/L GSH時(shí)效果，可以顯著提高凍融后精子品質(zhì)，還可以在一定程度上提高體外授精卵裂率及囊胚率[51]。

3 展 望

隨著生殖生物學(xué)、低溫生物學(xué)和人工授精技術(shù)研究發(fā)展，抗氧化劑和精液的長(zhǎng)期保存研究也越來(lái)越深入，對(duì)山羊遺傳資源的長(zhǎng)期保持和輔助繁殖技術(shù)都有著極為重要的意義。但由于精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性，在冷凍保存過(guò)程中，精子細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，ROS攜帶著氧化性極強(qiáng)的自由基,易與精子質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)抗氧化平衡體系，影響精子解凍后的品質(zhì)，包括運(yùn)動(dòng)能力、形態(tài)結(jié)構(gòu)、頂體的完整性，DNA的完整性及活率等。雖然甘油、卵黃等冷凍保護(hù)劑已廣泛應(yīng)用到山羊精液冷凍保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究中，但在繁殖生產(chǎn)中任存在很大程度的限制性，如在降溫過(guò)程中冰晶化的產(chǎn)生對(duì)精子的機(jī)械損傷和物理?yè)p傷。為維持凍融后精子結(jié)構(gòu)的完整性及膜的通透性，關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)及修飾的生物學(xué)功能，提高精子質(zhì)量及優(yōu)良公畜的利用率。因此，進(jìn)一步探索冷凍損傷的機(jī)理、分子組成結(jié)構(gòu)及外源性抗氧化劑、抗凍保護(hù)劑以及膜保護(hù)劑的研究，稀釋配方、冷凍解凍程序的優(yōu)化組合，為推動(dòng)精液冷凍保存技術(shù)的快速發(fā)展，優(yōu)質(zhì)資源的保護(hù)及利用提供更多技術(shù)保障，促進(jìn)山羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。