汪開拓 蔣永波 王富敏 張幫奎 馬 莉 顧 欣

(1 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404000；2 重慶匯達(dá)檸檬科技集團(tuán)有限公司，重慶 402660)

檸檬[Citruslimon(L.)Burm.F.]為蕓香科柑橘屬常綠小喬木植物，其果實(shí)呈翠綠或亮黃色，果汁酸澀，富含維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和酚類等各種微量元素，兼具良好的食品加工特征和保健價(jià)值[1]。檸檬苦素是近年來被廣泛研究的檸檬呈苦物質(zhì)，屬氧化性四環(huán)三萜類有機(jī)物。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)該化合物具有有效降低血脂、促進(jìn)腸道菌落平衡、提高神經(jīng)興奮性、預(yù)防腫瘤和改善免疫力等功能，富集和開發(fā)價(jià)值極高[2]。但是，檸檬果實(shí)深加工過程中產(chǎn)生大量的碎籽，由于缺乏成熟的開發(fā)策略，現(xiàn)階段只能被迫填埋或丟棄，造成巨大的資源損耗和環(huán)境污染。因此，高效分離和提取檸檬籽粒中的苦素類物質(zhì)，對(duì)于檸檬資源綜合開發(fā)極富現(xiàn)實(shí)意義[3]。

離子液體(ionic liquid)是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子所構(gòu)成的低沸點(diǎn)緩沖鹽溶液，具有溶解性強(qiáng)、熔融優(yōu)良和電離緩沖范圍大等優(yōu)點(diǎn)[4]。但單一離子液體性狀穩(wěn)定性差，通常將其與無機(jī)鹽形成離子液體雙水相體系，該體系具有揮發(fā)度和乳化性低、回收率高、平衡度高、易于放大等優(yōu)點(diǎn)，可有效克服單一離子液體的缺點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于高分子有機(jī)物的分離和純化操作[5]。本研究擬首先從弱酸性離子液體雙水相體系[BMG][BF4]/KH2PO4、[PHMG][PF6]/KH2PO4、[TMG][Br]/NaH2PO4和[TMG][Cl]/NaH2PO4中初篩出檸檬苦素最優(yōu)提取體系，再優(yōu)化相關(guān)操作工藝，以期獲得從檸檬籽粒中高效提取檸檬苦素的方法，為檸檬苦素的工業(yè)化分離和純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬籽粒，由重慶市潼南區(qū)某檸檬深加工企業(yè)提供，以檸檬果實(shí)深加工后的破碎籽粒居多，粒徑區(qū)間4.83±0.68 mm，含水量58.59%±3.73%；焦性沒食子酸、綠原酸、蘆丁、楊梅黃酮、槲皮素-3-o-蕓香苷、檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品(≥95%)，美國Sigma公司；AB-8大孔吸附樹脂，昆山市東鴻化工有限公司；乙腈、四氫呋喃，均為色譜純，上海吉至生化科技有限公司；四甲基胍鹽酸鹽([TMG][Cl])、四甲基胍的溴酸鹽([TMG][Br])、甲基丁基胍的四氟硼酸鹽([BMG][BF4])、聚六亞甲基胍的六氟磷酸鹽([PHMG][PF6])，上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司；無水乙醇、石油醚、丙酮、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸銨，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；試驗(yàn)用水為重蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

HMB-700S小型研磨式超微粉碎機(jī)，弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司；DH-300T試驗(yàn)篩，新鄉(xiāng)市大漢振動(dòng)機(jī)械有限公司；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海錦賦實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋、FW135中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；JC101電熱鼓風(fēng)干燥箱，南通嘉程儀器有限公司；PS-40Ultrasonic cleaner，深圳市潔康洗凈電器有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 將檸檬籽粒在40～45℃條件下緩慢烘干至水分含量約10%，用超微粉碎機(jī)研磨粉碎，過300目篩得到干燥的檸檬籽粉末。然后將檸檬籽粉末加入10%乙醇溶液，調(diào)節(jié)液料比至15∶1，再加入0.5 mol·L-1檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至4.8。最后加入0.15%混合水解酶(果膠酶∶纖維素酶∶淀粉酶=1∶1∶2)于35℃下水解8 h[6]。酶解結(jié)束后過濾得到酶解濾液轉(zhuǎn)移到8 000～14 000截留分子量的透析袋中，置于2 000 倍體積以上的無菌蒸餾水中靜置24 h以脫去微量無機(jī)鹽，再將酶解液在40℃下減壓(0.02～0.03 MPa)濃縮至原體積的10%，備用。

1.3.2 離子液體雙水相提取方法及評(píng)價(jià) 選擇4種弱酸性離子液體雙水相體系，即[BMG][BF4]/KH2PO4、[PHMG][PF6]/KH2PO4、[TMG][Br]/NaH2PO4和[TMG][Cl]/NaH2PO4，這些溶液均為胍鹽離子液體，具有一定分子識(shí)別能力，選擇性較好。參考Lin等[7]的方法，配制濃度為1.5～2.5 mol·L-1[BMG][BF4]/1.8～2.0 mol·L-1KH2PO4、1.8～2.8 mol·L-1[PHMG][PF6]/0.8～1.0 mol·L-1KH2PO4、1.0～1.5 mol·L-1[TMG][Br]/1.2～1.5 mol·L-1NaH2PO4和0.5～1.5 mol·L-1[TMG][Cl]/1.2～1.5 mol·L-1NaH2PO4等4種胍鹽離子液體雙水相萃取體系，隨后加入KBr，調(diào)節(jié)pH值至6.0。在1.3.1制備的濃縮酶解液中加入10倍上述各離子液體雙水相溶液，隨后置于40～80℃水浴鍋中保溫提取60～120 min，最后用0.5 mol·L-1檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值至3.5(使檸檬苦素電離平衡后帶正電并向離子相富集)，在10℃下靜置12 h待提取溶液分層，下層為水相，上層為離子相，分離上層離子相備用。向離子相溶液中加入30%～70%乙醇溶液進(jìn)行萃取(液料比1∶15～1∶30)，分離上層有機(jī)相，冷凍干燥(40 Pa、-50℃)后得到檸檬苦素粗粉，用40%乙醇溶液復(fù)溶，再用醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0，離心得到上清液再冷凍干燥后得到高純度檸檬苦素粉末。

計(jì)算無機(jī)相和離子水相體積比(R)、檸檬苦素在雙水相體系中的分配系數(shù)(KLimonin)及萃取率(YLimonin)[8]。比較各雙水相系統(tǒng)對(duì)應(yīng)分配系數(shù)和萃取率的大小，確定最佳的提取體系。相關(guān)計(jì)算公式如下：

KLimonin=CILimonin/COLimonin

(1)

YLimonin=[1/(1+R×KLimonin)]×100%

(2)

式中，CILimonin為無機(jī)相中檸檬苦素的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)； COLimonin為有機(jī)相中檸檬苦素的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 根據(jù)1.3.2試驗(yàn)結(jié)果選擇最優(yōu)離子液體雙水相萃取體系提取檸檬籽粒中檸檬苦素，分別以乙醇濃度50%、液料比20∶1、提取時(shí)間120 min、提取溫度70℃為固定水平，提取溫度設(shè)置為40、50、60、70、80℃，提取時(shí)間設(shè)置為60、90、120、150、180 min，萃取離子相檸檬苦素的乙醇溶液體積濃度設(shè)置為30%、40%、50%、60%、70%、80%，液料比設(shè)定為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，以乙醇萃取液中檸檬苦素含量為考察值，分析各因素對(duì)該離子液體雙水相體系提取效率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取條件 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert 10.1軟件中的Box-Behnken程序?qū)μ崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化。以提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)、乙醇溶液體積濃度(X3)和液料比(X4)為自變量，以檸檬苦素含量為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平交互表(表1)。各組試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 檸檬苦素含量測(cè)定 參照陳靜等[9]的高效液相色譜法。使用Agilent 1100高效液相色譜儀測(cè)定，色譜柱reverse Nova-Pak C18分析柱(250 mm× 4.6 mm, 10 μm)。流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-水(體積比為17.5∶17.5∶65)，流速0.5 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，在207 nm波長處檢測(cè)，應(yīng)用外標(biāo)法定量

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Independent factors and the levels used in Box-Behnken experimental design

分析提取液中檸檬苦素含量，結(jié)果以mg·g-1FW表示。

1.3.6 檸檬苦素抗氧化活性評(píng)價(jià) 將1.3.5提取的檸檬苦素乙醇提取液稀釋至10、20、30、40、50 μg·L-1，選擇代表性的水果酚酸(焦性沒食子酸和綠原酸)、類黃酮(蘆丁和楊梅黃酮)和花色苷(槲皮素-3-o-蕓香苷)[10]，同樣配置濃度梯度均為10、20、30、40、50 μg·L-1的焦性沒食子酸、綠原酸、蘆丁、楊梅黃酮、槲皮素-3-o-蕓香苷的乙醇溶液，橫向比較檸檬苦素與這5種功能性物質(zhì)在抗氧化活性方面的差異。

DPPH自由基清除率參考Yang等[11]的方法測(cè)定，ABTS+自由基清除率參照Schaich等[12]的方法測(cè)定，超氧陰離子和羥自由基清除率參照單科開等[13]的方法測(cè)定，結(jié)果均按自由基清除百分率表示；總還原力參照Oraiza[14]的方法測(cè)定，以反應(yīng)液在600 nm波長處的吸光度值表示還原力水平；亞油酸過氧化抑制率參考Hinneburg等[15]的方法測(cè)定，結(jié)果以過氧化抑制百分率表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 10.1軟件構(gòu)建回歸方程，通過方差分析計(jì)算各因素最佳水平，并預(yù)測(cè)最優(yōu)檸檬苦素提取量。統(tǒng)計(jì)分析中顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系的選擇

由表2～5可知，4種離子液體雙水相體系下，各體系中檸檬苦素分配系數(shù)KLimonin均遠(yuǎn)小于1，說明檸檬苦素主要集中在離子相，在雙水相體系下提取難度?。籟TMG][Br]/NaH2PO4和[TMG][Cl]/NaH2PO4的KLimonin顯著低于[BMG][BF4]/KH2PO4和[PHMG][PF6]/KH2PO4(P<0.05)，且1.5 mol·L-1[TMG][Cl]/1.35 mol·L-1NaH2PO4雙水相體系的K值最小，分配效率最高，分離效果最好。同時(shí)，4種離子液體雙水相體系的檸檬苦素萃取率YLimonin值均在較高水平，其中Y值平均值較高的是[TMG][Br]/NaH2PO4和[TMG][Cl]/NaH2PO4體系，說明這2種體系對(duì)檸檬苦素的提取效果最好。通過比較表2數(shù)據(jù)，選擇1.5 mol·L-1[TMG][Cl]/1.35 mol·L-1NaH2PO4離子液體雙水相體系作為檸檬苦素提取劑，后續(xù)試驗(yàn)即優(yōu)化該雙水相萃取體系的最佳操作條件。

表2 [BMG][BF4]離子液體雙水相體系對(duì)檸檬籽粒 中檸檬苦素提取效率的影響Table 2 Effects of [BMG][BF4] ionic liquid aqueous two-phase separation systems (ILs-ATPs) on extraction of limonin from lemon seeds

表3 [PHMG][PF6]離子液體雙水相體系對(duì) 檸檬籽粒中檸檬苦素提取效率的影響Table 3 Effects of [PHMG][PF6] ionic liquid aqueous two-phase separation systems (ILs-ATPs) on extraction of limonin from lemon seeds

表4 [TMG][Br]離子液體雙水相體系對(duì) 檸檬籽粒中檸檬苦素提取效率的影響Table 4 Effects of [TMG][Br] ionic liquid aqueous two-phase separation systems (ILs-ATPs) on extraction of limonin from lemon seeds

表5 [TMG][Cl]離子液體雙水相體系對(duì) 檸檬籽粒中檸檬苦素提取效率的影響Table 5 Effects of [TMG][Cl] ionic liquid aqueous two-phase separation systems (ILs-ATPs) on extraction of limonin from lemon seeds

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1-A可知，當(dāng)乙醇濃度為50%、液料比為20∶1、提取時(shí)間為120 min時(shí)，檸檬苦素提取量隨提取溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在提取溫度為70℃時(shí)，檸檬苦素提取量出現(xiàn)峰值。同時(shí)，當(dāng)乙醇濃度為50%、液料比為20∶1、提取溫度為70℃時(shí)，檸檬苦素提取量隨提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為90 min時(shí)，檸檬苦素提取量達(dá)到最大值(圖1-B)。當(dāng)提取溫度為70℃、提取時(shí)間為90 min、液料比為20∶1時(shí)，乙醇濃度為50%～70%時(shí)，檸檬苦素提取量較大，其中當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，提取量最大(圖1-C)。當(dāng)提取溫度為70℃、提取時(shí)間為90 min、乙醇濃度為60%時(shí)，液料比大小與檸檬苦素提取量呈正相關(guān)，但液料比大于20∶1時(shí)，檸檬苦素提取量上升趨勢(shì)逐漸變緩，考慮到成本，選擇液料比20∶1作為最佳條件(圖1-D)。因此，針對(duì)[TMG][Cl]/NaH2PO4離子液體相提取體系的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取溫度70℃、提取時(shí)間90 min、乙醇濃度60%、液料比20∶1為各參數(shù)的最優(yōu)值，可據(jù)此進(jìn)行下一步整體優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)和回歸模型的建立 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的因素中心點(diǎn)和表1的水平設(shè)計(jì)來優(yōu)化離子液體雙水相提取檸檬苦素的操作參數(shù)，優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果(檸檬苦素提取量)見表6。使用Design Expert 10.1軟件，以所得檸檬苦素提取量為響應(yīng)值(Y)，得到檸檬苦素含量關(guān)于提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)、乙醇濃度(X3)和液料比(X4)的四元二次方程：

Y=a0+ a1X1+ a2X2+ a3X3+ a4X4+ a12X1X2+ a13X1X3+ a14X1X4+ a23X2X3+ a24X2X4+ a34X3X4+ a11X12+ a22X22+ a33X32+ a44X42

(1)

圖1 提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)對(duì)檸檬籽粒中檸檬苦素提取量的影響Fig.1 Effects of extraction temperature (A), time (B), ethanol concentration (C) and liquid-material ratio (D) on limonin yield from lemon seeds

式中，a0為截距，a1、a2、a3和a4為各因素的一次系數(shù)，a11、a22、a33和a44為平方系數(shù)，a12、a13、a14、a23、a24和a34為交互作用系數(shù)。

將表1中的檸檬苦素提取量實(shí)測(cè)值和對(duì)應(yīng)的因素水平帶入方程(1)進(jìn)行多元擬合，可解出離子相液體中檸檬苦素提取量對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度和液料比各實(shí)際水平值的四元二次回歸方程，即

Y=-106.64+2.18X1+0.39X2+0.76X3+0.19X4-12 854.21X1X2+53 624.34X1X3+0.017X1X4-81 542.52X2X3-37 348.33X2X4-0.014X3X4-0.018X12-15 192.44X22-33 251.85X32-80 130.91X42

(2)

通過方程(2)可預(yù)測(cè)各因素在不同水平組合條件下從離子相液體中萃取出的檸檬苦素含量，其數(shù)值同見表6。

因此，以檸檬苦素提取量為響應(yīng)值的回歸方程整體及各主要因素均較顯著，方程相關(guān)系數(shù)高，數(shù)據(jù)誤差較小，此方程可用于對(duì)檸檬籽粒中檸檬苦素實(shí)際提取量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3.3 響應(yīng)面分析 利用Design Expert 10.1軟件制作各因素響應(yīng)曲面和等高線圖，結(jié)果見圖2。等高線圖可用于評(píng)價(jià)各因素間交互作用的強(qiáng)弱，曲面圖可確定各因素的最佳水平范圍[16]。由圖2-A可知，曲面隨著提取溫度和提取時(shí)間的增加，響應(yīng)值(檸檬苦素提取量)先升高再逐漸降低，當(dāng)提取溫度為65～75℃、提取時(shí)間為75～105 min時(shí)，檸檬苦素提取量急大；而當(dāng)提取溫度低于62℃或高于78℃時(shí)，提取時(shí)間高于110 min或低于60 min時(shí)，檸檬苦素提取量急劇下降。提取溫度和提取時(shí)間的曲面圖形態(tài)平緩，等高線圖呈圓形，暗示此兩因素的水平交互作用不顯著(P=0.898 9)， 故在實(shí)際生產(chǎn)中可單獨(dú)設(shè)定二者的最優(yōu)參數(shù)。

由圖2-B可知，當(dāng)其他條件不變時(shí)，不斷增加提取溫度和乙醇濃度，檸檬苦素提取量先快速升高后緩慢降低，乙醇濃度在55%～65%范圍內(nèi)，檸檬苦素提取量較高。提取溫度和提取時(shí)間的曲面圖在乙醇濃度方向上陡峭，同時(shí)等高線呈橢圓形，表明二者交互作用明顯，具有顯著性(P=0.035 7)。

隨著提取溫度和液料比逐漸增加，檸檬苦素提取量響應(yīng)值先緩慢升高后迅速降低，液料比為20∶1左右時(shí)，檸檬苦素提取量有明顯峰值。提取溫度和液料比的等高線圖橢圓形明顯，交互作用顯著(P=0.014 5)(圖2-C)。

圖2-D中曲面平緩，暗示提取時(shí)間和乙醇濃度兩因素對(duì)檸檬苦素提取量的影響不顯著，且等高線圖可進(jìn)一步確認(rèn)二者交互作用不顯著(P=0.425 4)。其他條件不變，不斷增加提取時(shí)間和液料比，檸檬苦素提取量先升高后降低，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，且由等高線圖可知兩者交互作用不顯著(P=0.081 1，圖3-E)。由圖3-F可知，乙醇濃度和液料比相對(duì)較低時(shí)，增加二者數(shù)值，檸檬苦素提取量緩慢增加，而達(dá)峰值后降幅有限；等高線呈彎曲狀，說明兩因素間交互作用顯著(P=0.038 1)。

表6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of optimizing tests by response surface method (RSD)

表7 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of response surface regression model

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)檸檬籽粒中檸檬苦素提取量的多水平試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表6)，結(jié)合Design Expert軟件對(duì)回歸方程(2)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在提取時(shí)間90.74 min、乙醇濃度59.40%、提取溫度74.22℃、液料比18.08∶1的條件下，從檸檬籽粒中提取的檸檬苦素最大理論預(yù)測(cè)提取量為12.126 mg·g-1FW。為檢驗(yàn)該模型的可重復(fù)性，同時(shí)方便實(shí)際生產(chǎn)，將檸檬苦素提取工藝調(diào)整為提取時(shí)間91 min、乙醇濃度60%、提取溫度74℃、液料比18∶1。 在此水平下進(jìn)行驗(yàn)證提取試驗(yàn)，重復(fù)3次。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，提取的檸檬苦素提取量為12.381 mg·g-1FW，較預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為+2.11%，差異不顯著(P=0.05)，證明此四元二次方程模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度高。

2.5 檸檬苦素抗氧化活性分析

由圖3可知，在10～50 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，檸檬苦素對(duì)各自由基均展現(xiàn)了較強(qiáng)的清除能力并有效抑制了亞油酸的過氧化水平，其總還原力與花色苷類物質(zhì)相比無顯著差異(P>0.05)且處于最高水平；檸檬苦素抗氧化活性與其濃度呈明顯正相關(guān)。同時(shí)，檸檬苦素對(duì)亞油酸過氧化的抑制水平顯著高于其他抗氧化物質(zhì)(P<0.05)，對(duì)ABTS+自由基的清除率也明顯高于同水平的焦性沒食子酸和綠原酸，然而檸檬苦素對(duì)活性氧自由基(超氧陰離子)的清除力顯著低于黃酮類和花色苷類化合物(P<0.05)。

3 討論

圖2 試驗(yàn)交互因素影響檸檬苦素提取量的曲面圖和等高線圖Fig.2 Surface and contour plots of experimental interaction factors affecting limonin yield

圖3 不同濃度下檸檬苦素及代表性酚酸、黃酮和花色苷對(duì)DPPH(A)、ABTS+(B)、 超氧陰離子(C)、羥自由基(D)清除率，亞油酸過氧化抑制率(E)和總還原力(F)的影響Fig.3 Effects of limonin and representative phenolic acid, flavonoids and anthocyanins on scavenging rates of DPPH (A), ABTS+ (B), superoxide anion (C) and hydroxyl (D) radicals, inhibition rate of linoleic acid peroxidation (E) as well as reducing power (F) at different concentrations

近年來離子液體的雙水相體系被證實(shí)能高效提取多糖、酚類、維生素及蛋白質(zhì)等各種功能性物質(zhì)[17-19]。從機(jī)理上看，離子液體飽和蒸氣壓低，粘度和溫度調(diào)控范圍大，對(duì)極性和非極性溶劑均有一定的溶解性，因此通過構(gòu)建離子液體雙水相是一種可充分發(fā)揮離子液體高效萃取特性的策略[4]。相較于傳統(tǒng)的雙水相萃取體系(如聚乙二醇-葡聚糖體系)，憎水性弱的離子液體與無機(jī)鹽構(gòu)成離子液體雙水相體系，操作條件溫和，萃取過程穩(wěn)定，安全性和分離效率高，且對(duì)于功能性生物大分子具有較好的萃取選擇性和保護(hù)作用[20]。本研究中，[BMG][BF4]/KH2PO4、[PHMG][PF6]/KH2PO4、[TMG][Br]/NaH2PO4和[TMG][Cl]/NaH2PO44種胍類離子液體雙水相系統(tǒng)能有效地將檸檬苦素從檸檬籽粒初提液中萃取至離子相中，其中以小分子的四甲基胍鹽([TMG])為基礎(chǔ)構(gòu)成的離子液體雙水相體系相比分子量較大的甲基丁基胍([BMG])和聚六亞甲基胍的六氟磷酸鹽([PHMG])的體系分離檸檬苦素效果較好，其原因可能是由于[TMG]與檸檬苦素分子量均較小，二者氫鍵作用力不易受空間位阻影響，結(jié)合程度高。與本研究結(jié)果相類似，采用1-乙基咪唑氯鹽離子為基礎(chǔ)的離子液體雙水相體系也對(duì)小分子綠原酸有很好的萃取效果[21]；[bmim][BF4]也可將金絲桃苷和異槲皮苷等中藥提取成分有效濃縮至上相中，達(dá)到萃取目的[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在離子液體雙水相提取檸檬苦素過程中，提取溫度對(duì)提取效率影響較大。這主要是由于雙水相萃取過程中，在一定pH值(或等電點(diǎn))條件下，適當(dāng)提高溫度可促進(jìn)體系熵值的增加以及疏水相互作用力，使帶弱電的苦素類物質(zhì)從NaH2PO4相轉(zhuǎn)移至離子液體相，從而達(dá)到進(jìn)一步提純的效果[23]。本研究采用乙醇溶液富集萃取離子相中的檸檬苦素，乙醇安全性高、成本低，當(dāng)乙醇加入離子液體中時(shí)，離子液體相中的陰離子可通過氫鍵結(jié)合乙醇，使檸檬苦素在離子相中溶解度下降并逐漸釋放至醇相中，這為后續(xù)的減壓濃縮和進(jìn)一步提純提供了基礎(chǔ)[24-25]。

檸檬苦素是廣泛存在于柑橘屬或楝科屬植物中的一種三萜類化合物，動(dòng)物試驗(yàn)研究證實(shí)檸檬苦素具有激活谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S- transferase，GST)活性和抑制活性氧自由基過度積累的功能，從而預(yù)防正常細(xì)胞的癌變[26-27]；同時(shí)，檸檬苦素也能直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有極強(qiáng)的抗癌活性[28]。前期有關(guān)楊梅[10]和草莓[29]的研究表明，酚酸、黃酮和花色苷類均具有較強(qiáng)抗氧化活性，可有效清除組織內(nèi)過量自由基，維持活性氧代謝的平衡，因此本研究橫向比較了檸檬苦素與典型酚酸、黃酮和花色苷類物質(zhì)在抗氧化水平方面的差異。結(jié)果顯示，在10～50 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，檸檬苦素均可有效清除DPPH和ABTS+自由基并能減少活性氧自由基的積累，顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性；同時(shí)，相比于酚酸、黃酮和花色苷類物質(zhì)，檸檬苦素能更顯著地抑制亞油酸的過氧化進(jìn)程，這暗示檸檬苦素具有提升細(xì)胞膜中脂肪酸的不飽和程度從而維持膜流動(dòng)性的作用[30]。

4 結(jié)論

本研究建立了[TMG][Cl]/NaH2PO4雙水相體系對(duì)檸檬籽粒中檸檬苦素提取量的回歸預(yù)測(cè)模型，通過擬合試驗(yàn)得出最佳提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間90.74 min、乙醇濃度59.40%、提取溫度74.22℃、液料比18.08∶1，此條件下檸檬苦素提取量12.126 mg·g-1FW， 較單因素提取量有顯著提高，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝效率高，可操作性好。功能性試驗(yàn)表明，檸檬苦素具有較強(qiáng)抗氧化活性，可有效清除活性氧自由基并抑制不飽和脂肪酸的過氧化，是一種具有開發(fā)前景的功能性食品資源。本研究為高效開發(fā)檸檬苦素資源提供了可行方案，但相關(guān)離子液體的制備較為繁瑣，試劑成本也較高，需開發(fā)簡便易行的試劑回收方法；同時(shí)，離子液體雙水相體系提取的檸檬苦素提取液中還含有其他苦素類成分(如諾米林)，因此相關(guān)提取液仍可進(jìn)一步分離純化，以獲得純度更高的苦素類單體成分。