金如昌，杜鄧襄，李旭欣，楊 涵，劉江江，郭金潔，張 丹，張方東

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 武漢 430070)

玉米是中國(guó)第一大作物，不僅可以作為糧食直接食用，又可作為飼料、工業(yè)原料等，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的作用。隨著人口快速的增長(zhǎng)，可耕地面積的不斷減少，全球氣候變暖等問(wèn)題，使得糧食生產(chǎn)遭受巨大的挑戰(zhàn)，提高玉米單位面積產(chǎn)量顯得更加重要。玉米產(chǎn)量是一個(gè)較為復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，受多種基因與環(huán)境作用所控制。其中，光合作用、氮素同化、碳源分配、植株株型等生理過(guò)程是產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)[1]。近幾十年來(lái)，隨著一些控制產(chǎn)量形成過(guò)程中相關(guān)基因逐漸被發(fā)現(xiàn)，基因工程技術(shù)在提高玉米產(chǎn)量方面取得巨大進(jìn)展[2]。Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在玉米中過(guò)表達(dá)shrunken-2基因和brittle-2基因，增加15%玉米種子產(chǎn)量。Xie等[4]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Zmdar1、Zmda1基因玉米純合株系中穗粒數(shù)增加，粒質(zhì)量顯著增加，小區(qū)產(chǎn)量提高15%～22%。最近，Wang等[5]在玉米中過(guò)表達(dá)ZmNF-YB16基因，其中過(guò)表達(dá)株系在正常條件下百粒質(zhì)量提高10%～16%，在干旱脅迫處理后百粒質(zhì)量提高61%～69%。以上說(shuō)明通過(guò)增強(qiáng)產(chǎn)量形成相關(guān)基因的表達(dá)，可以獲得使產(chǎn)量性狀明顯改善的轉(zhuǎn)基因玉米。

玉米籽粒胚乳約占玉米體積和干質(zhì)量的80%，胚乳發(fā)育過(guò)程中庫(kù)容的建成與庫(kù)容的充實(shí)程度一定程度上決定了玉米的粒質(zhì)量[6]。谷物種子的發(fā)育依靠從母體組織中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)生長(zhǎng)，但是由于母體和種子間不存在共生關(guān)系，韌皮部中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要從籽粒的母體一側(cè)卸下進(jìn)入質(zhì)外體，并由專門負(fù)責(zé)溶質(zhì)運(yùn)輸?shù)呐呷榧?xì)胞進(jìn)入體內(nèi)，這些細(xì)胞位于籽?；浚纬膳呷榛總鬟f細(xì)胞層(Basal Endosperm Transfer Layer，BETL)[7-9]。授粉后6～10d，位于胚乳基部的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為傳遞細(xì)胞，傳遞細(xì)胞形成一個(gè)廣泛的細(xì)胞壁生長(zhǎng)網(wǎng)絡(luò)，外層胚乳傳遞細(xì)胞向內(nèi)形成了明顯的溶質(zhì)梯度，從而有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向胚乳內(nèi)部的運(yùn)輸[10-11]。目前在玉米BETL細(xì)胞表達(dá)的許多基因，已經(jīng)被鑒定出來(lái)[12-15]。其中ZmMRP-1(ZeamaysMYB-related-Protein1)，是第一個(gè)鑒定出來(lái)的具有反式特異激活傳遞細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。ZmMRP-1編碼一個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子屬于R1MYB蛋白SHAQKYF家族[15]。ZmMRP-1的轉(zhuǎn)錄起始于胚乳發(fā)育的早期階段，在授粉3d后首先檢測(cè)到ZmMRP-1表達(dá)，并且在傳遞細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中持續(xù)存在。ZmMRP-1可與MEG1、ZmTCRR-1、ZmBETL-1、ZmBETL-2等傳遞細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因結(jié)合[16-18]，調(diào)控胚乳傳遞細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，從而在玉米傳遞細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮中重要作用。最近Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)，在開(kāi)放授粉的Krug黃馬齒(Krug Yellow Dent)群體中選育出來(lái)的大粒(Krug Large Seed，KLS)和小粒(Krug Small Seed，KSS)自交系群體，比較大種子和小種子群體的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)，KLS出現(xiàn)較高的ZmMRP-1表達(dá)水平，且表現(xiàn)為籽粒灌漿速率增加，提示ZmMRP-1在這一過(guò)程中可能通過(guò)對(duì)傳遞細(xì)胞層的分化和功能具有重要作用。

本試驗(yàn)構(gòu)建攜帶有玉米ZmMRP-1基因過(guò)表達(dá)載體pHZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1，利用農(nóng)桿菌侵染愈傷組織的方法導(dǎo)入玉米自交系A(chǔ)188中，通過(guò)提高該基因在玉米中的表達(dá)，以期望獲得產(chǎn)量性狀改良的玉米新株系，為高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米新品種的選育提供材料支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米(ZeamaysL.)自交系A(chǔ)188、根癌農(nóng)桿菌(Agrobactriumtumefaciens)菌株EHA105、中間載體質(zhì)粒pHZM1N-Rsc[20]，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米課題組保存。

1.2 載體的構(gòu)建與鑒定

ZmMRP-1啟動(dòng)子序列和ZmMRP-1orf序列均來(lái)源于Gómez 等[15]，ZmMRP-1的轉(zhuǎn)錄終止序列term來(lái)自玉米R(shí)s基因的終止序列[21]，4XEnhancer序列來(lái)自O(shè)dell等[22]，以上序列設(shè)計(jì)好連接，合成在pUC57質(zhì)粒的HindIII-EcoR1，然后亞克隆到pHZM1N-Rsc的pfi23II-XmaJ1位置，構(gòu)成pHZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1轉(zhuǎn)化載體，由南京金斯瑞公司完成。將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，由于ZmMRP-1是玉米內(nèi)源基因，根據(jù)目的基因序列與啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小662 bp，引物序列ZmMRP-1F：5′-ATCAACCCGGCTAGTCCAAC-3′，ZmMRP-1R：5′-CATCA- GGTAGCCCTGCATCA-3′；標(biāo)記基因egfp-iptII，擴(kuò)增產(chǎn)物大小960 bp，egfp-iptIIF： 5′-CAAAGACCCAACGAGAAGC-3′，egfp-iptIIR：5′-AAAGCCCTCACCATCTCCATCTCCTC-3′。PCR反應(yīng)體系(15 μL)：模板DNA 30 ng，Primer R(5 μmol/L)0.5 μL，Primer F(5 μmol/L)0.5 μL，2×Taqplus Master Mix 7.5 μL，ddH2O補(bǔ)至15 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s， 57 ℃ 30 s，72℃ 1 min(30循環(huán))，72 ℃ 5 min。

1.3 農(nóng)桿菌侵染玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化玉米 ZmMRP-1基因

1.3.1 農(nóng)桿菌菌液制備 將攜帶有pHZM1N-P::ZmMRP-1載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105，在含有抗生素利福平(50 mg/L)和卡那霉素 (50 mg/L)的固體LB培養(yǎng)基上劃線，28 ℃倒置暗培養(yǎng)2 d，挑取單克隆于加有抗生素的液體LB培養(yǎng)基中28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)，低速離心，收集菌液至50 mL的離心管中，加入含有 0.1 mmol/L的乙酰丁香酮(AS)侵染液，28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)。測(cè)定OD600值，將OD值調(diào)至0.4～0.5。

1.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織 選取授粉10 d左右的A188幼胚誘導(dǎo)愈傷，挑選顏色鮮亮、質(zhì)地松軟的玉米愈傷組織；將愈傷組織置入含農(nóng)桿菌的侵染液中浸泡30 min，共培養(yǎng)基中 19 ℃暗培養(yǎng)3 d。3 d后，用加特美汀的無(wú)菌水清洗愈傷組織5～6次直至水澄清為止；吹干愈傷組織后，轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中。待愈傷組織恢復(fù)后，在熒光燈下挑取帶有綠色熒光愈傷組織，在42 ℃條件下熱激2 h，重復(fù)3次，以完全剔除標(biāo)記基因[20]。將熱激處理過(guò)后的愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基，時(shí)間為3～4周，之后將大小為2～3 cm左右的再生芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待苗長(zhǎng)5～8 cm，根數(shù)達(dá)到 20 條左右時(shí)，揭蓋煉苗 2 d，挑選健壯的小苗轉(zhuǎn)入溫室種植[23]。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

通過(guò)CTAB法小量提取植株幼嫩葉片總DNA，對(duì)目的基因ZmMRP-1進(jìn)行PCR檢測(cè)，所用引物及體系見(jiàn)“1.2”，篩選陽(yáng)性植株。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot檢測(cè)

根據(jù)ZmMRP-1基因設(shè)計(jì)特異性探針，以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增1 169 bp片段，回收目的片段，采用Roche試劑盒對(duì)探針進(jìn)行地高辛標(biāo)記(Cat.No.11585614910)。CTAB法提取高純度大量基因組DNA，DNA 30 μg，10×L buffer 4 μL，KpnI50U，補(bǔ)ddH2O至40 μL，37 ℃酶切 16 h。酶切產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠下，30 V電壓，電泳16 h。利用毛細(xì)管法將電泳后的酶切產(chǎn)物印跡到尼龍膜上；依據(jù)地高辛試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雜交及顯影過(guò)程。

1.6 轉(zhuǎn) ZmMRP-1基因T2代植株轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)

T2代陽(yáng)性及野生型植株統(tǒng)一自交授粉后 3 d、6 d、12 d、15 d、21 d和30 d，用手術(shù)解剖刀分離胚乳，迅速放入液氮中保存。采用Trizol法，提取籽粒胚乳總RNA，用RNase-free DNaseⅠ(Thermo)消除基因組DNA；利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)把RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用引物qZmMRP-1F：5′-CCGAACTTCAACAGCGTGTG-3′，qZmMRP-1R：5′-CAGGTAGCCCTGCATCAT-3′，以玉米Actin基因(GRMZM2G126010)為內(nèi)參基因，根據(jù)SYBR Green qRT-PCR(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)試劑盒進(jìn)行操作，qRT-PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX96 Touch Realtime PCR detection system上進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，以WT中的ZmMRP-1表達(dá)量設(shè)為1，所有表達(dá)倍數(shù)使用2-△△Ct計(jì)算。反應(yīng)體系(20 μL)：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，Primer R (5 μmol/L)0.5 μL，Primer F(5 μmol/L) 0.5 μL ，ROX Reference Dye 0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.5 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(30循環(huán))，72 ℃ 5 min。

1.7 轉(zhuǎn)基因材料產(chǎn)量性狀分析

以T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系OE-8、OE-19，受體材料A188自交系為對(duì)照于2019年4月，播種在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)田中，各株系及對(duì)照在重復(fù)內(nèi)隨機(jī)排列，施肥及田間管理一致。待抽雄時(shí)，統(tǒng)計(jì)株高、穗位高。果穗成熟后，人工收獲，統(tǒng)計(jì)穗長(zhǎng)，穗行數(shù)等性狀，曬干脫水至恒質(zhì)量后，測(cè)定穗質(zhì)量、穗粗、粒長(zhǎng)、粒寬，稱量百粒質(zhì)量等產(chǎn)量相關(guān)性狀。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Excel 2018對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用SPSS(版本22.0.0)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s多重比對(duì)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)表達(dá) ZmMRP-1基因載體構(gòu)建及鑒定

本載體pHZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1由pHZM1N-Rsc為骨架構(gòu)建而來(lái)，載體中(圖1)使用融合基因egfp-iptII作為篩選標(biāo)記基因，通過(guò)熱激處理，hsp70熱激啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre重組酶基因表達(dá)，切除載體LoxP位點(diǎn)間的序列，從而獲得無(wú)篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。

對(duì)構(gòu)建好的載體通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，提取質(zhì)粒分別對(duì)目的基因ZmMRP-1，篩選標(biāo)記基因egfp-iptII進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖2)，結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照(載體質(zhì)粒)和農(nóng)桿菌中提取出來(lái)的質(zhì)粒均擴(kuò)增出來(lái)ZmMRP-1基因片段、篩選標(biāo)記基因egfp-iptII片段，陰性對(duì)照(ddH2O)無(wú)條帶，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證和已知序列一致，表明成功將pH ZM1N-PZmMRP-1::ZmMRP-1表達(dá)載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105中 。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米愈傷遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

采用玉米愈傷組織轉(zhuǎn)基因方法，對(duì)ZmMRP-1基因進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化流程如圖3，共獲得了121個(gè)農(nóng)藝性狀良好的的轉(zhuǎn)基因T0代植株，由于ZmMRP-1來(lái)源于玉米，結(jié)合對(duì)ZmMRP-1基因序列及啟動(dòng)子序列分析，設(shè)計(jì)鑒定轉(zhuǎn)基因植株特異性引物，檢測(cè)上游引物在啟動(dòng)子上，而下游引物在目的基因上。通過(guò)PCR反應(yīng)鑒定，來(lái)源于12個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的30個(gè)玉米植株擴(kuò)增出633 bp與陽(yáng)性對(duì)照相同的目的片段，陰性對(duì)照未轉(zhuǎn)基因植株自交系A(chǔ)188無(wú)條帶，部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4-A。初步說(shuō)明ZmMRP-1基因已經(jīng)進(jìn)入植物體內(nèi)，陽(yáng)性率為24.7%。對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性幼苗，嚴(yán)格自交授粉，單穂收獲。

圖1 載體pHZM1N-P ZmMRP-1::ZmMRP-1 T-DNA區(qū)Fig.1 Schematic of T-DNA region of pHZM1N-P ZmMRP-1::ZmMRP-1 vector

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的整合情況與表達(dá)量檢測(cè)

對(duì)部分陽(yáng)性T1代株系，提取基因組DNA進(jìn)行酶切，使用ZmMRP-1基因標(biāo)記特異性探針進(jìn)行Southern blot檢測(cè)(圖4-B)，結(jié)果表明OE-8、OE-10、OE-19只有一條雜交信號(hào)，且陰性對(duì)照非轉(zhuǎn)基因受體植株無(wú)條帶，說(shuō)明ZmMRP-1基因已經(jīng)整合到玉米基因組上，并且以單拷貝的形式存在。為了更加細(xì)致的了解ZmMRP-1在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)情況，我們利用qRT-PCR對(duì)T2代OE-8、OE-19單拷貝株系籽粒胚乳在自交授粉后3 d、6d、12 d、15 d、21 d和30 d進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。以同時(shí)期野生型材料為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株胚乳中ZmMRP-1基因從授粉后3 d開(kāi)始顯著上調(diào)，授粉后12 d表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到最高，之后表達(dá)量降低，授粉后30 d基本不表達(dá)(圖4-C)。

A. ZmMRP-1基因的PCR檢測(cè)；B.egfp-iptII基因的PCR檢測(cè)；M.DL 2000 marker，分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.質(zhì)粒PCR;N.陰性對(duì)照;P.陽(yáng)性對(duì)照

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量性狀分析

2019年對(duì)轉(zhuǎn)ZmMRP-1基因T2代株系OE-8、OE-19以及受體自交系A(chǔ)188進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)性狀考察，由圖5和表 1可知轉(zhuǎn)基因植株在粒長(zhǎng)、粒寬、百粒質(zhì)量、穗粗、穗質(zhì)量方面都極顯著增加，株高、穗位高、穂長(zhǎng)、穂行數(shù)、穂粒數(shù)方面并未出現(xiàn)明顯差異。測(cè)量籽粒大小，發(fā)現(xiàn)粒長(zhǎng)由0.85 cm增至0.90～0.93 cm，增加5.88%～9.41%；粒寬由0.73 cm增至0.77～0.80 cm，增加5.48%～ 9.59%；百粒質(zhì)量由17.26 g增至 18.67～19.02 g，增加了8.17%～10.20%。結(jié)果表明，在玉米中過(guò)表達(dá)ZmMRP-1基因，通過(guò)提高玉米籽粒粒寬、粒長(zhǎng)、百粒質(zhì)量的方式以達(dá)到改善玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀目的。

A.轉(zhuǎn) ZmMRP-1基因植株的PCR檢測(cè)，M.DL2000 marker，1-4.轉(zhuǎn)基因植株，N.陰性對(duì)照，P.陽(yáng)性對(duì)照；B.轉(zhuǎn) ZmMRP-1基因的Southern blot檢測(cè)，M.DNAmarker，P.陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照，WT.非轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，OE-18、OE-10、OE-19轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，經(jīng)KpnI單酶切后，使用基因特異性探針進(jìn)行雜交；C.轉(zhuǎn) ZmMRP-1基因材料授粉后不同時(shí)間表達(dá)量，圖中所示數(shù)據(jù)為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

WT.未轉(zhuǎn)基因A188自交系，OE-8、OE-19為過(guò)表達(dá) ZmMRP-1玉米株系，Bar=2 cm

3 討論與結(jié)論

玉米的產(chǎn)量主要受到源、庫(kù)、流的影響，三者之間既相互促進(jìn)，又相互制約[24]，根據(jù)玉米高產(chǎn)理論指導(dǎo)，從這三個(gè)主要途徑采取常規(guī)措施，提高玉米的產(chǎn)量的科學(xué)研究都有報(bào)道[25-27]。通過(guò)基因工程手段，在玉米中過(guò)量表達(dá)與源、庫(kù)、流的相關(guān)基因，也可以為創(chuàng)制高產(chǎn)玉米新材料提供幫助。如在玉米中過(guò)量表達(dá)谷氨酰胺合成酶Gln1-3基因，轉(zhuǎn)基因植株功能葉氮含量和光合效率明顯高于對(duì)照，進(jìn)而增加產(chǎn)量[28]；在玉米中過(guò)表達(dá)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因，顯著增強(qiáng)了光合產(chǎn)物運(yùn)輸中卸載能力，增加玉米粒質(zhì)量和粒數(shù)并提高淀粉含量[2]；轉(zhuǎn)海藻糖-6-磷酸酯酶基因，降低了糖合成代謝的抑制信號(hào)，解除了籽粒中的糖合成代謝的限制因素，進(jìn)而提高玉米正常和干旱條件下的產(chǎn)量[29]；增強(qiáng)KNR6基因的表達(dá)，能夠促進(jìn)玉米果穗的發(fā)育，增加了玉米穂長(zhǎng)和行粒數(shù)，來(lái)提高玉米庫(kù)容量[30]?！傲鳌弊鳛槿齻€(gè)要素的中間環(huán)節(jié)，連接源和庫(kù)。葉片運(yùn)出同化物到貯存或活躍生長(zhǎng)的“庫(kù)”的運(yùn)輸是由若干個(gè)生理過(guò)程和結(jié)構(gòu)所控制的，是一個(gè)高度完整的體系，包括韌皮部的裝載、篩管中運(yùn)輸、韌皮部卸出和同化物的重新吸收[24]。在維管束組織與胚乳之間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞中，玉米胚乳基部傳遞細(xì)胞層處于“流”中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)胚乳吸收營(yíng)養(yǎng)成分具有起著重要的作用。另外，ZmMRP-1是調(diào)節(jié)下游許多基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，但是關(guān)于ZmMRP-1基因自身的調(diào)控目前的研究不多。玉米ZmMRP-1的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，受到細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的活性調(diào)節(jié)，也即受到蔗糖濃度的調(diào)節(jié)[31]。在這里ZmMRP-1基因的調(diào)控通路與蔗糖在轉(zhuǎn)移細(xì)胞層的卸載轉(zhuǎn)運(yùn)等發(fā)生了密切的聯(lián)系，但具體的機(jī)制還不清楚。而本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化基因ZmMRP-1是用的自身啟動(dòng)子，同樣會(huì)受到上游轉(zhuǎn)化酶活性和蔗糖的調(diào)節(jié)。同時(shí)，增強(qiáng)表達(dá)的ZmMRP-1基因又會(huì)調(diào)節(jié)下游的基因加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。目前對(duì)本實(shí)驗(yàn)中得到的轉(zhuǎn)基因材料還暫時(shí)沒(méi)有開(kāi)展上游和下游方面的研究。如果能進(jìn)一步的深入探索闡明相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的具體細(xì)節(jié)，再通過(guò)遺傳操作技術(shù)，解除抑制環(huán)節(jié)，增強(qiáng)促進(jìn)環(huán)節(jié)，應(yīng)該有更好的效果。

表1 轉(zhuǎn) ZmMRP-1基因植株農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic characters of ZmMRP-1 transgenic plant

在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)中，基因的啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而決定性狀表現(xiàn)的重要因素之一，利用具有特異性調(diào)控作用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子是受體植物外源基因表達(dá)效率的關(guān)鍵[32]。目前啟動(dòng)子大致有三類，組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。組成型表達(dá)啟動(dòng)子如水稻Actin1、玉米Ubi、35S等較早應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因工程中，但其往往在所有植物組織中轉(zhuǎn)錄，時(shí)空特異性差，使植物能耗增加，還容易導(dǎo)致基因沉默[33]。一些研究表明，選擇合適的某個(gè)組織特異性啟動(dòng)子可以避免非預(yù)期表型的產(chǎn)生，以及降低植物能耗，以保證目的基因在所預(yù)期的位置準(zhǔn)確高量的表達(dá)[34]。在本研究中，目的基因由自身啟動(dòng)子啟動(dòng)，在啟動(dòng)子前方有四個(gè)串聯(lián)而成的35S增強(qiáng)子序列，35S增強(qiáng)子只增強(qiáng)鄰近基因的表達(dá)，而不改變相鄰基因的特異表達(dá)時(shí)空性[35-37]，以保證ZmMRP-1基因能夠在粒質(zhì)量形成的關(guān)鍵時(shí)期和關(guān)鍵的部位高效的表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因ZmMRP-1的陽(yáng)性玉米材料的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)，說(shuō)明它只在授粉后的胚乳過(guò)量表達(dá)，在授粉后12 d達(dá)到峰值。同時(shí)，陽(yáng)性玉米材料的農(nóng)藝性狀與陰性對(duì)照沒(méi)有顯著差別，也間接說(shuō)明轉(zhuǎn)ZmMRP-1基因沒(méi)有干擾其他部位的發(fā)育。

本研究利用轉(zhuǎn)基因的方法，成功獲得了過(guò)表達(dá)ZmMRP-1基因單拷貝株系，通過(guò)提高粒長(zhǎng)、粒寬、百粒質(zhì)量等方式，進(jìn)而改良了玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀，但由于轉(zhuǎn)基因受體為A188自交系，其植株矮小，產(chǎn)量較低，不能直接用于玉米高產(chǎn)雜交育種親本。需要將該轉(zhuǎn)基因材料回交導(dǎo)入骨干自交系中，進(jìn)一步鑒定過(guò)表達(dá)ZmMRP-1基因的增產(chǎn)效應(yīng)，然后作為玉米高產(chǎn)育種的基礎(chǔ)材料。