閆超凡,葉麗麗,陳余道，陳永山,張 軍a,蔣金平

(1.桂林理工大學 a.廣西環(huán)境污染控制理論與技術重點實驗室; b.廣西巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西 桂林 541006; 2.河南匯商環(huán)?？萍加邢薰?，鄭州 450000；3.泉州師范學院 資源與環(huán)境科學學院,福建 泉州 362000)

0 引 言

自然界中,土壤重金屬污染大多數(shù)是兩種或兩種以上重金屬元素共同作用而形成的復合污染[1],相比單個元素的污染,多個元素之間的拮抗、協(xié)同和加和作用使得重金屬對作物的影響機理更為復雜[2],而且不同復合污染對于不同的植物來說影響因子和效果不同[3-6]。燕麥作為糧、飼兼用作物,在中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著特殊的地位[7], 有關重金屬對燕麥影響的研究也有不少,例如:高濃度Hg、 Cd能夠顯著抑制燕麥幼苗莖葉的生長速率和葉綠素含量,但低濃度的Hg、Cd在一定程度上可以促進燕麥幼苗的生長[8-10]; Cu2+能夠顯著提高燕麥幼苗葉的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性, 過量的Cu2+會導致植物葉片在光氧化反應中迅速衰老[11];毒性的增大一般會降低植物體內(nèi)酶活性[12]; 施寵等[10]研究發(fā)現(xiàn),當Cd2+濃度達到15 mg/L時,會導致野燕麥的超氧化物岐化酶、 過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶CAT活性降低,但Cd2+濃度為8 mg/L以下時,酶活性增加,促進了燕麥的生長;Tiecher等[13]研究發(fā)現(xiàn),外源添加Cu和Zn含量達到60和120 mg/kg時,黑燕麥幼苗 CAT、POD活性明顯降低,但葉綠素含量出現(xiàn)異常高峰等。以上研究側重于燕麥幼苗期、單個重金屬對其生理特征的影響,且大都屬于外源添加重金屬,無法了解自然污染條件下多金屬污染對燕麥生長過程的影響及重金屬的累積效應。

鑒于此, 以Pb、 Zn、 Cd、 Hg、 As 5種不同濃度的重金屬復合污染土壤為供試土壤, 研究重金屬復合污染對燕麥生長及重金屬富集的影響, 以期為重金屬復合污染土壤的治理與有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采集于廣西壯族自治區(qū)陽朔縣思的村重金屬污染農(nóng)田(N24°59′, E110°33′)。該地區(qū)以山地、丘陵為主,處于亞熱帶季風性氣候區(qū),年平均氣溫在 20 ℃,年降雨量達1 900～2 000 mm。土壤采集過程中,先借助手持式重金屬快速測定儀(Genius 9000 XRF)粗略測定土壤的主要重金屬濃度,然后按照重金屬污染程度高低分成 9 個濃度水平,依次標記為 A～I 處理,并選擇無重金屬污染的農(nóng)田作為對照(CK)。 采集的土壤帶回實驗室后風干并過2 mm(10目)篩,去除石塊及雜物后用于盆栽供試土壤,理化性質(zhì)見表1。

表1 土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of test soil

1.2 盆栽試驗設計

按照處理梯度每個硬質(zhì)塑料桶(20 cm×40 cm×30 cm)盛裝風干土約4.5 kg, 每個重金屬濃度水平設種植和不種植燕麥(牧樂思, 加拿大進口)各4個重復, 并施入復合肥1 g作為基肥。 在種植前對土壤潤濕并穩(wěn)定1周, 每桶20顆種子, 以旱作方式栽培。 播種一周左右記錄燕麥發(fā)芽率, 此后每隔15 d測量燕麥株高, 待三葉期時取燕麥新鮮葉片進行植物酶活性測定, 隨后進行間苗, 出苗80 d后分別采集燕麥地上和地下部分, 清洗、 烘干、 稱重, 粉碎保存。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤化學性質(zhì)測定 土壤pH、有機碳、全氮、全磷、全鉀的具體測定方法參照《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[14]。

1.3.2 燕麥生理指標測定 采集新鮮的燕麥葉片, 選用南京建成生物工程研究所提供的SOD試劑盒、 POD試劑盒分別測定燕麥幼苗期葉片SOD 活性以及 POD 活性, 按照給定的方法計算 SOD 和 POD 的含量。 采用95%乙醇研磨提取葉綠素, 并在665和649 nm波長下, 測定吸光度進而分析其含量; 葉片丙二醛(malondialdehyde,MDA) 含量的測定采用硫代巴比妥酸法[15]。

1.3.3 重金屬全量及形態(tài)測定 土壤和燕麥植株中As、Hg全量均采用王水水浴消解,原子熒光分光光度計(AS-20)測定； Pb、 Zn、 Cd全量采用硝酸-過氧化氫體系消解, 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定；土壤重金屬形態(tài)測定采用改進BCR法,提取態(tài)采用DTPA浸提[16]。

1.3.4 土壤重金屬污染評價方法[17]采用潛在生態(tài)危害指數(shù)法進行土壤重金屬污染評價:

(1)

(2)

(3)

1.4 樣品數(shù)據(jù)準確度控制與數(shù)據(jù)分析

土壤和植物樣品測試過程中,設置3個平行試驗及空白樣和標準物質(zhì)樣,采用標準物質(zhì)樣品GSS-4(GBW07405), GSB-6(GBW10015)進行質(zhì)量控制,控制試驗回收率在90%～110%。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010、Origin 9.0、SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計與分析。

2 結 果

2.1 土壤污染等級劃分及形態(tài)分析

利用潛在生態(tài)危害指數(shù)法對盆栽土壤重金屬污染等級進行劃分, 標準值以《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準(試行)》為準。 由表2可知, CK～I污染程度逐漸提高: 對照土壤存在輕微的潛在生態(tài)危害,A 屬于強污染, B～E屬于很強污染, F～I屬于極強污染。其中，處理A強污染梯度：Cd濃度約是標準值的10倍,Pb、Zn濃度分別約為標準值的4和3倍；處理B～E很強污染梯度：Cd濃度最大為標準值的31倍,Pb濃度最大約為標準值的12倍,Zn濃度最大約為標準值6倍；處理F～I極強污染梯度：Cd濃度最大為標準值的65倍,Pb、Zn最大濃度分別約為標準值的51、34倍。在CK～I梯度范圍內(nèi)As濃度都低于標準值,而Hg含量相對較低，僅E～F處理超標，且超標倍數(shù)在1～2。

表2 土壤重金屬含量及污染等級Table 2 Heavy metal content and pollution grading in soil

土壤的重金屬各形態(tài)分布如圖1所示。供試土壤的主要形態(tài)是殘渣態(tài),除CK外,其他處理Pb、Zn弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)與可氧化態(tài)之和占比多超過50%,其中Pb有效態(tài)占比最高達56%；而Cd在F、H、I極強污染梯度的弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)與可氧化態(tài)之和占比均大于80%,且有效態(tài)占比最高達80%以上；Hg在CK～C各梯度三態(tài)之和占比均大于40%,有效態(tài)含量在CK～B占比最高達60%以上;As在整個梯度上三態(tài)之和占比最高只有25%,有效態(tài)As占比最高只有4%左右。綜上可見,重金屬形態(tài)與有效態(tài)存在一定的正相關性。

2.2 重金屬復合污染對燕麥生長的影響

多重金屬污染脅迫下, 燕麥的發(fā)芽率及株高狀況見表3。燕麥的發(fā)芽率受重金屬復合污染脅迫影響不大, 除了極強污染處理 I 以外, 其他重金屬污染程度燕麥發(fā)芽率都在93%以上, 有可能是I處理Cd濃度含量過高,損害了種子的胚芽而致。 CK～E 處理的燕麥株高隨時間呈逐漸增高趨勢, 但增幅逐漸降低, 最大增幅達到74.9%, 最小增幅只有1.5%; F～I處理隨著污染加重, 燕麥生長受到抑制程度加深, 在極強污染I處理中，燕麥出苗20 d后死亡。

燕麥地上部分的鮮重和干重呈近似正態(tài)分布(圖 2), 地下部分干重也呈現(xiàn)先升后降的趨勢; 重金屬很強污染程度的C處理燕麥生物量最大, 與對照CK和最小值G處理相比差異性顯著(p<0.05), 鮮重分別增加了41.24%、 71.16%, 地上干重則分別增加了31.37%、 68.62%。

圖2 燕麥鮮重和干重Fig.2 Fresh and dry weight of oat samples

2.2.1 重金屬濃度與燕麥株高、生物量的多元回歸分析 為了進一步了解復合重金屬污染對燕麥生長的影響,以株高、鮮重、地上部分、地下部分為因變量，分別設為Y1、Y2、Y3、Y4,Pb、Zn、Cd、As、Hg為自變量，分別設為X1、X2、X3、X4、X5進行多元回歸分析(表4)?？芍?Pb、As對燕麥株高、鮮重、地上、地下干重有顯著的抑制作用,而Zn、Cd、Hg對其有顯著的協(xié)同促進作用(p< 0.05)。地下干重主要受Pb、Zn、As抑制較大,而Cd、Hg有一定的促進作用。

表4 重金屬濃度與燕麥生長特征多元回歸分析Table 4 Multivariate regression analysis between heavy metal contents and growth characteristics of oat samples

2.3 重金屬復合污染對燕麥生理特征的影響

2.3.1 重金屬復合污染對燕麥葉綠素含量的影響 由表5可見, 與對照(CK)相比, 各處理的葉綠素a和b均有不同幅度的下降, 處理H的降幅最大, 分別為70.19%、 70.23%;處理B～H葉綠素a降幅均達顯著水平, 除處理D外, 處理A～H葉綠素b降幅也達顯著水平(p< 0.05)。 葉綠素wa/wb變化則無明顯規(guī)律, 升降幅度均未達到顯著水平。

表5 重金屬復合污染下燕麥葉綠素含量Table 5 Chlorophyll contents of oat samples under compound pollution of heavy metals

2.3.2 復合污染對燕麥酶活性的影響 多重金屬復合污染脅迫下燕麥葉片POD、SOD活性在不同處理之間變化較小,而MDA含量隨重金屬脅迫濃度的升高整體呈現(xiàn)近似“M”狀變化(圖3); POD活性處理E達到最大值446.01 U/g FW,且最大增幅只有4.7%; SOD活性處理G最大, CK最小, 兩者差異性顯著, 最大增幅為39.37%; MDA含量變化復雜, 處理F含量最高, 為7.31 nmol/g FW, 處理CK含量最低, 為4.85 nmol/g FW, 顯著低于其他處理(p< 0.05)。

圖3 燕麥新鮮葉片酶活性Fig.3 Enzyme activity in fresh leaves of oat samples

2.3.3 重金屬有效態(tài)與燕麥生理特征相關性分析 重金屬有效態(tài)是可以被動植物等生物體吸收利用的金屬形態(tài),由表 6 可知,Pb、Zn、Cd有效態(tài)與燕麥葉綠素a、b呈極顯著負相關(p< 0.01), Zn、 Cd有效態(tài)與SOD、 POD呈顯著負相關(p< 0.05);MDA含量與5種金屬提取態(tài)之間無明顯相關性,且有效態(tài)低的As、Hg對燕麥生理特征也無顯著相關性。

表6 重金屬有效態(tài)與燕麥生理特征相關分析Table 6 Relationship between the effective state of heavy metals and the physiological characteristics of oat

2.4 復合污染對燕麥重金屬累積的影響

由圖4可知, 同一污染水平下燕麥重金屬含量地上部分低于地下部分, 除了重金屬Pb以外, 燕麥地下重金屬濃度最大值都出現(xiàn)在處理H, 地上部分除了Hg外, 最大值都出現(xiàn)在處理F。 重金屬積累量Zn>As>Pb>Hg>Cd, 富集系數(shù)Hg>As>Cd>Zn>Pb, 轉(zhuǎn)運系數(shù)Cd>Zn>Hg>As>Pb。與CK相比, 除As外， 地上、 地下部分重金屬含量都隨處理濃度的增加有不同程度的提高, 其中地下部分Pb含量最大提高了約8 989%, Zn最大約478%, Cd最大約2 309%, Hg最大約1 820%; 地上部分Pb最大提高了約1 771%, Zn最大約1 842%, Cd最大約422%, Hg最大約627%。

圖4 燕麥植物體中重金屬含量Fig.4 Heavy metal contents in oat plant

2.4.1 重金屬形態(tài)對燕麥吸收重金屬的影響 土壤重金屬能被植物吸收很大程度上取決于其形態(tài),重金屬不同形態(tài)的植物有效性不同[18]。由表7可以看出,弱酸提取態(tài)的Cd、可氧化態(tài)As與莖葉Cd、As含量呈現(xiàn)極顯著相關性(p< 0.01)。根部Zn積累量與4種金屬形態(tài)都呈顯著正相關性,Pb則呈極顯著正相關(p< 0.01),Cd可氧化、還原態(tài)與根部Cd累積呈極顯著正相關(p< 0.01),而Hg則與殘渣態(tài)呈顯著正相關(p< 0.05),因此,重金屬形態(tài)對燕麥根部重金屬吸收的影響大于莖葉。

表7 燕麥重金屬含量與土壤重金屬形態(tài)Pearson相關系數(shù)Table 7 Pearson coefficients between the concentration of heavy metals in oat samples and heavy metal speciation in soil

通過多元逐步回歸分析可知(表8),弱酸提取態(tài)Pb、可氧化態(tài)Zn、Cd以及殘渣態(tài)Hg與燕麥吸收Pb、Zn、Cd、Hg量之間存在統(tǒng)計學意義上的高度相關性;同時看出燕麥吸收As量與土壤中各形態(tài)As均無明顯的統(tǒng)計學意義上的相關和回歸性,這可能與供試As含量較小，以及其他金屬的相互作用影響燕麥對As的吸收有關[19]。

表8 燕麥重金屬吸收量與土壤重金屬形態(tài)之間的多元逐步回歸方程Table 8 Multiple stepwise regression equation between heavy metal in oat and heavy metal speciation in soil

3 討 論

3.1 重金屬復合污染對燕麥生長的影響

重金屬脅迫下,植物體內(nèi)產(chǎn)生過量的過氧化氫、乙烯等物質(zhì),對植物新陳代謝和酶活性具有負效應[12]。由表3可以看出,燕麥的發(fā)芽率除了I處理，普遍在90%以上,供試土壤pH值偏酸性,在極強污染下發(fā)芽率仍如此之高,有可能是特定的土壤酸堿度可以在一定程度提高燕麥的發(fā)芽率,這與武俊英[20]在燕麥耐鹽生理特征中的研究有相似之處。燕麥的株高以處理F為界,前后差異顯著,后期呈近似正態(tài)分布;燕麥的鮮重、地上干重也以處理F為界,前后差異顯著(p< 0.05)。侯鑫狄等[21]研究表明，鹽堿程度對燕麥株高影響沒有燕麥的品種大,而對燕麥生長的其他特征影響較大,所以出現(xiàn)此現(xiàn)象有可能是不同的金屬元素之間產(chǎn)生了拮抗作用[22]以及偏酸性的土壤特性導致的。多元回歸分析方程表明,重金屬Pb是抑制燕麥生長的主要元素,處理F～H的土壤Pb含量嚴重超標,破壞了燕麥的生理結構,導致植株矮小枯黃,這與張艷麗[23]的研究結果相似;另外,土壤中含量最大的Pb、Zn能夠抑制根部生長,其地下部分干重雖無明顯差異但是質(zhì)量很輕,可知其根系發(fā)展受到限制;As雖然對燕麥的生長也存在抑制作用,但是其含量遠低于標準值,抑制程度較低。

3.2 重金屬復合污染對燕麥生理特征的影響

重金屬脅迫會導致活性氧在植物細胞內(nèi)形成,破壞細胞膜結構、酶系統(tǒng)和蛋白質(zhì)等生物大分子,從而影響植物的生理特征[24]。隨著污染程度的增加,燕麥葉綠素a和b含量呈逐漸降低趨勢,而葉綠素wa/wb呈上升趨勢,這與鹽堿程度對燕麥葉綠素的影響結果一致[20],但供試土壤呈弱酸性,說明是重金屬嚴重破壞了燕麥的光合作用所致,相關分析也表明，有效態(tài)Pb、Zn、Cd對燕麥葉綠素a和b毒害作用明顯(p< 0.01),Astolfi等[8]、Tiecher等[13]的研究也證明了這點。丙二醛的含量在一定程度上能反映膜脂的過氧化作用強度及膜損傷程度,SOD、 POD活性則是抗氧化能力強弱的表現(xiàn)[24], 燕麥MDA含量隨污染等級增加變化趨勢與鹽堿脅迫下的變化相似, 而POD活性隨污染等級提升基本無變化, SOD活性都高于CK, 與鹽堿地脅迫情況相差較大[25]; 燕麥SOD、POD及MDA含量分別在處理E、G、F到達最大值,相關分析可知Zn、Cd有效態(tài)含量與SOD、POD活性呈顯著負相關(p<0.05)。而處理E有效態(tài)Zn、Cd占比低于其他梯度,Pb占比高于其他梯度；處理G有效態(tài)Cd占比與E相比增高,Zn變化不大,但Pb占比大幅下降,所以導致SOD、POD最大值出現(xiàn)在不同梯度的原因可能與有效態(tài)Zn、Cd、Pb的含量變化有關；MDA含量在處理F最大可能是Cd有效態(tài)占比太高所致;另外，燕麥鮮重也是從處理E開始大幅下降,說明重金屬的毒害作用從處理E逐漸加重,燕麥的酶保護系統(tǒng)逐漸被破壞。

3.3 復合污染及其重金屬形態(tài)對燕麥重金屬積累的影響

土壤重金屬主要通過根部進入植物體內(nèi),重金屬在不同的植物體內(nèi)有不同的遷移、轉(zhuǎn)化和富集機制,Cu、Cd等都會在植物根部富集,往地上部分的遷移率很小[26-27];黑燕麥會在根部富集并固定Cu、Pb、Zn、Cd、Cr重金屬元素,且Zn含量在地上、地下部分都很高[13, 28]。本文研究結果表明，燕麥對Pb、Zn、Cd、Hg、As的富集在不同的處理下均呈現(xiàn)出地下部分累積量大于地上部分,且Pb、As被根部固定明顯;隨著污染等級的提升呈現(xiàn)逐漸升高趨勢,富集量最大的元素是Zn,且地上、地下部分富集量都很大,這與Tiecher等[13]對黑燕麥吸收Cu、Zn的研究結果一致,雖然Zn的有效態(tài)占比大部分低于Cd、Hg和Pb,但可提取態(tài)(BCR法)占比高, 且毒性系數(shù)最小, 才導致雖然累積量大, 但燕麥的株高、 鮮重和地上部分干重在CK～E梯度都是呈上升趨勢, 相關分析(表7)中4種形態(tài)的Zn都與根部Zn呈顯著正相關(p<0.05)也證明了這一點。

由形態(tài)分析可知,Pb、Zn的4種形態(tài)對根部重金屬吸收影響顯著,但對莖葉無影響；燕麥根部吸收Cd主要受可氧化、還原態(tài)影響,而莖葉則與弱酸提取態(tài)呈顯著正相關；Hg的殘渣態(tài)與As的可氧化態(tài)分別對燕麥的根和莖葉吸收量呈正相關，其中Hg、Pb、Zn殘渣態(tài)與根部吸收量相關性顯著,可能是因為都以殘渣態(tài)為主要形態(tài),而燕麥在生長的過程中,根系的新陳代謝可能改變了土壤的氧化還原等特性,影響了其他形態(tài)的活性[29],而且由燕麥的重金屬富集特征Zn> As> Pb> Hg> Cd可知,活性較低的As、Zn卻是吸收量較大的元素,而活性較高的Cd、Pb元素卻富集較少,很有可能是因為燕麥的生長鈍化了Cd活性,卻提高了Hg、Zn、As的活性所致。

4 結 論

(1)多金屬脅迫下燕麥的株高、鮮重、地上干重呈近似正態(tài)分布,通過多元回歸分析發(fā)現(xiàn),Pb、Zn、As是影響燕麥生長的重要元素。

(2)多金屬脅迫下燕麥葉綠素a、b含量隨潛在生態(tài)危害指數(shù)RI的提高逐漸下降,而SOD、POD活性無顯著變化,MDA含量無明顯變化規(guī)律。相關性分析表明,燕麥生理特征主要受有效態(tài)Pb、Zn、Cd含量的影響。

(3)多金屬脅迫下燕麥吸收重金屬含量Zn>As>Pb>Hg>Cd,且隨著RI的提高呈上升趨勢,相關分析和逐步多元回歸方程表明燕麥吸收重金屬主要受可氧化態(tài)、弱酸提取態(tài)和殘渣態(tài)影響。