田地

2020年的諾貝爾化學(xué)獎授予美國加州大學(xué)伯克利分校教授詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）和在德國馬克斯·普朗克感染生物學(xué)研究所工作的法國教授埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier），以表彰她們發(fā)明基因修飾方法CRISPR-Cas9。

基因剪刀和基因編輯的原理

CRISPR的全稱有些拗口，為“規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)”（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。Cas是Caspase的簡稱，全稱是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。這是一組蛋白酶，Cas9是其中之一。此外，與CRISPR一起發(fā)揮功能的還有其他酶，如核酸酶蛋白Cpf1，因此也可稱為CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、CRISPR-C2c1和CRISPR- C2c2等，它們都是基因剪刀，但應(yīng)用最多的是CRISPR-Cas9。

CRISPR-Cas9是目前比較精確，而且切割速度較快的一種基因剪刀，利用這把剪刀可以對動物、植物和微生物的DNA進(jìn)行有目標(biāo)性的編輯加工（剪切、刪除、位移和增加等），從而治療疾病，尤其是遺傳病，以及獲得人們想要的作物和生物產(chǎn)品。

研究人員早就發(fā)現(xiàn)，CRISPR與很多能夠侵入細(xì)菌的噬菌體DNA序列相同，噬菌體DNA的這些序列在被轉(zhuǎn)錄為RNA后，就成為靶向RNA（gRNA），能夠和細(xì)菌產(chǎn)生的Cas蛋白形成復(fù)合體，并引導(dǎo)Cas蛋白。當(dāng)復(fù)合體檢測到入侵的DNA和靶向RNA序列一致時，Cas蛋白就能夠切割入侵的DNA，據(jù)此細(xì)菌可以保護(hù)自己，防御噬菌體的入侵。可以說，這是生物的一種天生的免疫防御機制。

當(dāng)CRISPR與Cas9結(jié)合成為CRISPRCas9系統(tǒng)時，就成為一種有目標(biāo)和能精確控制的基因剪刀，能比較準(zhǔn)確地切割某種基因。

杜德納和卡彭蒂耶正是因為證明了CRISPR-Cas9基因剪刀的準(zhǔn)確和有效而獲得今年的諾貝爾化學(xué)獎?？ㄅ淼僖趯θ祟愒斐蓸O大傷害的化膿性鏈球菌的研究中首先發(fā)現(xiàn)一種以前未知的分子—tracrRNA。研究表明，tracrRNA是細(xì)菌古老的免疫系統(tǒng)CRISPR/Cas的一部分，該系統(tǒng)通過切割噬菌體的DNA而解除其武裝，從而抵抗噬菌體DNA的侵入。2011年卡彭蒂耶發(fā)表了她的研究結(jié)果。

同一年，卡彭蒂耶與擁有豐富RNA知識的資深生物化學(xué)家杜德納合作，獲得突破性的成果。她們在2012年6月發(fā)表的論文中稱，其團(tuán)隊純化了Cas9蛋白，發(fā)現(xiàn)它是雙RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶，并首次在體外（試管中）證明使用Cas9的CRISPR系統(tǒng)可以切割任意DNA鏈，說明CRISPR在活細(xì)胞中有修改基因的能力。同時，她們簡化了基因剪刀的分子成分，創(chuàng)建了CRISPR-Cas9基因剪刀，因此更易于使用。她們是最早把細(xì)菌天然免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為CRISPR-Cas9基因剪刀的，并使其具有任意切割基因的功能。后來，卡彭蒂耶和杜德納又用CRISPR-Cas9基因剪刀成功編輯了大腸桿菌的基因，結(jié)果表明CRISPR-Cas9比起之前的其他基因剪刀更有效和準(zhǔn)確。

發(fā)現(xiàn)歷程和爭議

CRISPR被視為一種能改變整個生物領(lǐng)域的工具和成果，在疾病治療、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面有極大的應(yīng)用潛力。但是，CRISPR和CRISPR-Cas9的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明并非只有獲獎?wù)邇蓚€人的貢獻(xiàn)，而是一大批科學(xué)家不斷研究、相互印證的結(jié)果。

美國的《細(xì)胞》雜志曾發(fā)文回顧過CRISPR技術(shù)的早期發(fā)展過程，同時美國麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)博德研究所所長埃里克·蘭德也對CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)明過程有過總結(jié)。結(jié)合這兩者及其他研究，可以簡單歸納CRISPR和CRISPR-Cas9的發(fā)明過程。

1987年，日本科學(xué)家石野良純團(tuán)隊在分析大腸桿菌iap基因及周邊序列時偶然發(fā)現(xiàn)了一段位于3端存在29個核苷酸高度同源的重復(fù)序列，它們被含32個核苷酸的序列間隔開，由此揭開了CRISPR的面紗。

1993年，西班牙科學(xué)家弗朗西斯科·莫伊卡在嗜鹽古細(xì)菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了大約30個堿基對（bp）長度的回文重復(fù)序列（CRISPR），這些序列由36個堿基對的間隔序列隔開。2005年，莫伊卡又發(fā)現(xiàn)CRISPR序列中2/3的間隔序列為病毒或外源質(zhì)粒的序列，因而認(rèn)定CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)。

2005年，法國科學(xué)家吉利斯·維格諾德和俄羅斯科學(xué)家亞歷山大·博洛廷也證明，CRISPR與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)。

2007年，服務(wù)于杜邦公司的法國分子生物學(xué)家菲利普·霍瓦特等人在研究生產(chǎn)酸奶的乳酸桿菌對噬菌體的抗性時，發(fā)現(xiàn)了Cas7和Cas9蛋白在CRISPR中的作用，Cas7產(chǎn)生間隔和重復(fù)序列，Cas9則是核酸酶。

2008年8月，荷蘭科學(xué)家范德歐斯特等人鑒定了一系列Cas蛋白，發(fā)現(xiàn)這些蛋白需要切割61個堿基對的前體RNA（crRNA）才有功能，由此弄清了crRNA的作用。他們據(jù)此人工設(shè)計相應(yīng)的crRNA序列，使細(xì)菌獲得了抵抗噬菌體的特性。這是人類首次編輯CRISPR系統(tǒng)。

2008年12月，阿根廷科學(xué)家盧西亞諾·馬拉夫尼團(tuán)隊證實CRISPR系統(tǒng)的底物是DNA，并且提出該系統(tǒng)有可能用于DNA編輯，是一種有效的基因剪刀。

2010年12月，加拿大拉瓦爾大學(xué)的西爾萬·莫伊諾證實了Cas9可以在crRNA的指導(dǎo)下切割特定序列的DNA。

2011年7月，立陶宛科學(xué)家維吉尼亞斯·斯克斯尼斯在大腸桿菌中重組了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)，提出CRISPR-Cas9要成為一把精準(zhǔn)有效的基因剪刀至少需要Cas9、crRNA和反式激活crRNA（tracrRNA）。

2012年8月，卡彭蒂耶和杜德納發(fā)表論文，揭示CRISPR-Cas9基因剪刀可以進(jìn)行準(zhǔn)確的基因編輯。她們對CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了簡化，將tracrRNA與crRNA嵌合成一條單鏈向?qū)В╯gRNA），只需sgRNA和Cas9蛋白兩個組分即可靶向特定的序列，至此CRISPR-Cas9這種高效簡單的基因組編輯技術(shù)（基因剪刀）問世。

2013年1月，麻省理工學(xué)院教授、華裔科學(xué)家張鋒和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授喬治·邱奇同時在《科學(xué)》雜志上分別發(fā)表論文，證明CRISPR-Cas9可以編輯哺乳動物細(xì)胞基因，而且成功地編輯了小鼠和人類細(xì)胞的基因。幾周之后，杜德納實驗室也發(fā)表了類似的結(jié)果。

因此有人認(rèn)為，張鋒也有可能因為發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9可應(yīng)用于人類細(xì)胞而獲得諾貝爾獎，并且張鋒與杜德納等人在過去也打了多起關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用的專利官司，雙方各有勝負(fù)。而且石野良純因為首先發(fā)現(xiàn)了CRISPR也可能獲獎，另外西班牙的莫伊卡最先認(rèn)識到CRISPR的重要性，并且對其從結(jié)構(gòu)到功能的揭示都有卓越貢獻(xiàn)，也應(yīng)當(dāng)獲獎。但是，在諾貝爾獎委員會看來，在發(fā)現(xiàn)CRISPRCas9基因剪刀的過程中，只有卡彭蒂耶和杜德納二人的成果才是最關(guān)鍵的核心貢獻(xiàn)。

實際應(yīng)用

作為一種比較精準(zhǔn)而高效的基因剪刀，CRISPR-Cas9在各個領(lǐng)域，如生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化學(xué)等方面有著廣泛的用武之地。這種基因剪刀可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標(biāo)基因，包括人、老鼠、斑馬魚、細(xì)菌、果蠅、酵母、線蟲和農(nóng)作物細(xì)胞內(nèi)的基因，因此，它是一種用途極為廣泛的生物技術(shù)。

在農(nóng)作物方面，人們可以利用這一基因剪刀來生產(chǎn)抵抗霉菌、害蟲和干旱的農(nóng)作物，而且已經(jīng)取得了不少成果。2019年，肯尼亞國際熱帶農(nóng)業(yè)研究所的雅因達(dá)拉·特里帕斯團(tuán)隊就采用基因剪刀CRISPR-Cas9剪切了一種大香蕉基因組中的病毒DNA，使其不再讓香蕉產(chǎn)生條紋病。與未經(jīng)基因編輯的大香蕉相比，經(jīng)過編輯的大香蕉有75%沒有出現(xiàn)香蕉條紋病毒癥狀，這也意味著即便暴露在干旱壓力下，也能讓這種香蕉不受病毒的侵害，讓香蕉保產(chǎn)和增產(chǎn)。

在改造動物基因方面，基因剪刀也表現(xiàn)出了重要的價值。中國南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室等機構(gòu)的研究團(tuán)隊利用CRISPRCas9基因剪刀，首次在全球創(chuàng)造和孕育了兩只靶向基因編輯猴。創(chuàng)造靶向基因編輯猴的目的是建立猴子疾病模型，用來模擬人類、試驗藥物和治療遺傳病，從而降低藥物研究和以人為試驗對象的風(fēng)險。

研究人員利用CRISPR-Cas9基因剪刀修改了3個基因，即調(diào)節(jié)代謝的基因Ppar-γ、調(diào)節(jié)免疫功能的基因Rag1以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞和性別決定的基因。研究人員在180多個單細(xì)胞期猴胚胎中同時靶向編輯了這3個基因，然后對15個胚胎的基因組進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有8個胚胎顯示出兩個靶基因同時突變的證據(jù)。這兩個基因就是調(diào)節(jié)代謝的基因Ppar-γ和調(diào)節(jié)免疫功能的基因Rag1。此后，研究人員將這種經(jīng)過遺傳修飾的胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母猴體內(nèi)，其中一只母猴分娩出了一對孿生猴。對這對孿生猴的基因組進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，它們的DNA中確實存在兩個突變的靶基因。也因此把這兩只猴稱為靶向基因編輯猴。

2014年，美國貝勒醫(yī)學(xué)院張普民研究團(tuán)隊也采用CRISPR-Cas9基因剪刀制造出了能夠產(chǎn)生人類白蛋白的基因編輯豬。

2016年初，包括張鋒在內(nèi)的多個研究機構(gòu)的團(tuán)隊利用CRISPR-Cas9基因剪刀來治療動物的杜興氏肌肉萎縮癥遺傳病，結(jié)果提高了它們的預(yù)期壽命和生活質(zhì)量，這顯然是為治療人的杜興氏肌肉萎縮癥進(jìn)行的動物試驗。

此外，邱奇團(tuán)隊也正在利用CRISPR-Cas9基因剪刀來大量編輯豬的基因，去除豬的基因中對人有害的微生物，使其可以為人類提供器官，從而解決人體器官移植供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。

倫理和限制

CRISPR-Cas9基因剪刀同樣存在短板和缺陷，最大的短板是它可能脫靶，即這一基因剪刀可能會在DNA錯誤的位置進(jìn)行剪切，或脫離原有的設(shè)計目標(biāo)，造成意外傷害。如果是用于治療人的疾病，就有可能產(chǎn)生不可預(yù)控的嚴(yán)重后果。

2018年9月，《自然方法》發(fā)表一篇文章指出，在對小鼠的試驗中，CRISPR確實能夠成功矯正引發(fā)失明的基因，從而治療小鼠的失明。但是，有兩只接受基因剪刀治療的小鼠的基因組中存在超過1500個單核苷酸突變以及超過100處更大基因片段的缺失和插入。這便是脫靶造成的后果，而且可能危及小鼠的生命。

目前已知有超過4000種遺傳性單基因疾病，影響全球超過1%的新生兒。從理論上講，可以利用CRISPR-Cas9基因剪刀剪掉致病基因，以預(yù)防這些疾病，讓每個家庭都獲得健康嬰兒。這顯然比胎兒出生前的基因檢測更先進(jìn)。

但是，在實際操作中由于CRISPR-Cas9基因剪刀有脫靶的危險，因而用來治療人類疾病有巨大的風(fēng)險。2015年，中山大學(xué)的黃軍就團(tuán)隊采用基因剪刀CRISPR-Cas9修改導(dǎo) 致β地中海貧血的β珠蛋白基因（將有問題的鳥嘌呤G修改成腺嘌呤A，從而糾正地中海貧血的基因根源）獲得部分成功，但是這一研究結(jié)果被英國的《自然》和美國的《科學(xué)》雜志拒稿。理由是，這將引發(fā)無法預(yù)料的風(fēng)險。對人類胚胎的研究不進(jìn)行嚴(yán)格限制可能會導(dǎo)致不安全和不符合倫理地使用這種技術(shù)。

實際情況也表明，黃軍就團(tuán)隊采用CRISPRCas9基因剪刀的成功率并不高，脫靶明顯。他們對胚胎修改β地中海貧血的致病基因時，試驗了86個廢棄胚胎細(xì)胞，最終只有28個的基因被成功編輯修改，成功率約為33%。這個成功率并不足以獲得安全性和成功率的保障，也讓人們對此技術(shù)抱有疑慮。

2018年，中國南方科技大學(xué)生物系副教授賀建奎團(tuán)隊利用CRISPR-Cas9基因剪刀編輯了胚胎細(xì)胞中與艾滋病免疫有關(guān)的CCR5基因，以使嬰兒出生后具備先天性的免疫艾滋病的能力。研究團(tuán)隊稱，首先是利用猴子胚胎和小鼠來進(jìn)行CRISPR-Cas9編輯實驗，取得預(yù)期的效果，并發(fā)現(xiàn)小鼠的組織及行為與正常小鼠沒有顯著差異。2017年3月至2018年11月，賀建奎團(tuán)隊招募8對夫婦志愿者（艾滋病病毒抗體男方陽性、女方陰性）參與實驗。最終有2名志愿者懷孕，其中一人生下一對化名“露露”“娜娜”的雙胞胎女嬰。

這一事件引發(fā)了巨大爭議，由于CRISPRCas9基因剪刀存在不可避免的脫靶后果，將可能對后代產(chǎn)生其他方面的意想不到的危險，因此，這是一種違反醫(yī)學(xué)倫理的嚴(yán)重事件。2019年12月30日，基因編輯嬰兒事件在深圳市南山區(qū)人民法院一審公開宣判。賀建奎以非法行醫(yī)罪被判3年有期徒刑，并處罰金300萬元人民幣。

CRISPR-Cas9基因剪刀固然有巨大的應(yīng)用前景，而且也獲得了諾貝爾獎，但是在應(yīng)用于人和動物時，還存在巨大的風(fēng)險，需要由人類的倫理和法律來監(jiān)管。