孫菁蘭 王華敏 才恒 王麗娟 唐巧巧 劉之毅 高強

摘 要：Indigoidine是一種無毒的微生物天然藍色素。本研究利用重組大腸桿菌DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp發(fā)酵生產(chǎn)Indigoidine，通過單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的復合氮源比例及含量和兩階段控制溫度策略中的變溫點。結(jié)果表明：優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨5，酵母浸粉10，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5。優(yōu)化后的變溫點為37 ℃培養(yǎng)7 h時變溫至28 ℃，Indigoidine產(chǎn)量增加了3倍，從初始的0.35 g·L-1提高至1.4 g·L-1。

關(guān)鍵詞：Indigoidine;培養(yǎng)基優(yōu)化;變溫發(fā)酵;大腸桿菌

Abstract：Indigoidine is a nontoxic microbial blue pigment. In this work， indigoidine was produced by fermentation of recombinant E. coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp. Single factor experiment was employed to optimize the proportion and content of compound nitrogen source in fermentation medium and the variable temperature point of two-stage temperature control strategy. The optimized fermentation medium was as following （g·L-1）： tryptone 5， yeast extract 10， NaCl 10， MOPS 5. The optimal culture time at 37 ℃ was 7 h and then the temperature change to 28 ℃. Production of indigoidine from the initial 0.35 g·L-1 increased up to 3-fold at 1.4 g·L-1.

Key words：Indigoidine; Medium optimization; Variable-temperature fermentation; Escherichia coli

中圖分類號：TQ920.6

Indigoidine是一種來自微生物的天然藍色素，有近70多年的發(fā)現(xiàn)歷史，因其無毒、色澤明亮類似于靛藍，可作為新型天然藍色素及染料應用于食品、醫(yī)藥、染整等行業(yè)，已有將其用于蛋白質(zhì)類纖維織物的染色報道[1]。在分子生物學研究中，Indigoidine合成酶基因可作為標記基因構(gòu)建篩選體系[2-3]，近年來關(guān)于Indigoidine及其合成酶的應用研究也開始得到了重視[4]。

Indigoidine最早從植物病原菌歐文氏桿菌（Erwinia sp.）

中發(fā)現(xiàn)，近年來在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)其合成酶基因以沉默基因的形式存在[5]，經(jīng)其他宿主如大腸桿菌可異源表達并發(fā)酵生產(chǎn)Indigoidine[6-7]。Indigoidine合成酶（Indigoidine synthetase）是非核糖體肽合成酶，經(jīng)過4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活化，將微生物體內(nèi)的2分子谷氨酰胺合成為1分子Indigoidine[8]。該色素為非水溶性藍色素，具有抗菌性和氧化還原性，能溶解于少數(shù)的幾種有機溶劑，如DMF、DMSO、四氫呋喃、吡啶、N-甲基吡咯烷酮等[9]，結(jié)構(gòu)見圖1（a），其

N，N-二甲基甲酰胺溶液在λ=590 nm處有最大吸收峰[2]，可被連二亞硫酸鈉還原為隱色體形式Lecoindigoidine[3，9]，結(jié)構(gòu)見圖1（b）。

植物作為天然色素的生產(chǎn)者，雖然來源廣泛，但受自然環(huán)境影響大、含量低、生長周期緩慢、加工成本高，因此植物源天然藍色素價格偏高[10]。而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然藍色素可避免上述問題，易于工業(yè)化生產(chǎn)。目前如利用三孢布拉霉生產(chǎn)的β-胡蘿卜素和番茄紅素，紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲色素[11]已作為食品級微生物色素應用于食品行業(yè)。利用微生物法發(fā)酵生產(chǎn)天然藍色素，在一定程度上可以緩解市場上天然藍色素稀缺的問題，本文在成功表達idgS和sfp基因構(gòu)建產(chǎn)Indigoidine的重組大腸桿菌工程菌的基礎(chǔ)上，對其發(fā)酵生產(chǎn)Indigoidine的發(fā)酵培養(yǎng)基與變溫點進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗室構(gòu)建并保藏的一株含有Indigoidine合成酶基因（idgS）與4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶基因（sfp）的重組大腸桿菌工程菌E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp，其中攜帶idgS和sfp基因的pCIMt002質(zhì)粒，由中國科學院微生物研究所陳義華研究員饋贈。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，1×105 Pa滅菌20 min;固體培養(yǎng)基含2%瓊脂。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5，pH 7.0，1×105 Pa滅菌20 min。

1.3 試劑與儀器

酵母浸粉、胰蛋白胨（生化級，英國OXOID品牌）;N，N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，天津市津東天正精細化學試劑廠）;TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;SL 8型高速冷凍離心機[賽默飛世爾（中國）科技公司];ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

將菌株E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp經(jīng)三區(qū)劃線于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基活化，37 ℃過夜培養(yǎng)長出白色單菌落，然后變溫至28 ℃培養(yǎng)6～8 h后，白色單菌落變?yōu)樗{色，挑取藍色較深的單菌落于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)10～12 h，即為種子液。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

以1%（V/V）接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，發(fā)酵過程前期37 ℃培養(yǎng)4～10 h，后期28 ℃培養(yǎng)12 h，整個發(fā)酵過程搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

1.4.3 發(fā)酵優(yōu)化

培養(yǎng)基氮源優(yōu)化：優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中胰蛋白胨與酵母浸粉的比例和含量;發(fā)酵變溫點優(yōu)化：選取產(chǎn)量較高的不同氮源比例的培養(yǎng)基，發(fā)酵過程前期37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別選擇4、6、7、8 h和10 h，后期

28 ℃培養(yǎng)12 h。

1.4.4 Indigoidine產(chǎn)量測定

（1）Indigoidine標準曲線繪制。發(fā)酵液經(jīng)離心取沉淀，用蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷依次清洗2次，將沉淀中的色素超聲溶解于DMF中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥的方法獲取Indigoidine粗品。將色素粗品溶解

于DMF，配成濃度為1 g·L-1的母液，梯度稀釋為0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 g·L-1和0.500 g·L-1的色素溶液，在λ=590 nm處測量色素溶液吸光度值，重復3次（下同），制作Indigoidine標準曲線（見圖2）。

（2）Indigoidine產(chǎn)量計算。取發(fā)酵液50 mL于離心管中，12 000 r·min-1離心20 min，棄上清，用蒸餾水清洗沉淀2次。向沉淀中加入3 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），超聲1 h，12 000 r·min-1離心20 min，取上清色素溶液。在λ=590 nm處測量色素溶液吸光度值，若OD590大于0.8，則稀釋至0.2～0.8 g·L-1范圍內(nèi)測定，根據(jù)上述標準曲線換算得出Indigoidine產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基氮源含量優(yōu)化

按照1.4.2的方法，發(fā)酵前期37 ℃培養(yǎng)4 h后變溫至28 ℃培養(yǎng)12 h，測定發(fā)酵液中Indigoidine的產(chǎn)量。由圖3可知，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)量為0.35 g·L-1，當胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶10、0∶15時產(chǎn)量最高分別為0.55 g·L-1、0.57g·L-1，其次是胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶15的產(chǎn)量為0.44 g·L-1，上述3個比例的菌體濃度與色素產(chǎn)量都大于對照。

2.2 發(fā)酵變溫點優(yōu)化

由于2.1中37 ℃培養(yǎng)4 h后變溫，未能真正反映菌體產(chǎn)色素能力的真實水平。因此下一步實驗選擇上述3個產(chǎn)量較高的復合氮源比例，比較其在多個變溫點下的Indigoidine產(chǎn)量。由圖4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中同一比例的蛋白胨與酵母浸粉在不同變溫點下產(chǎn)量差異顯著。變溫點為4 h時，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為0∶15時產(chǎn)量最高為0.56 g·L-1，但在6～8 h時，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶10時，色素產(chǎn)量最大，其中變溫點為7 h時，產(chǎn)量最高為1.4 g·L-1。在各變溫點下，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶15的色素產(chǎn)量較5∶10低，可能是菌體濃度過高，發(fā)酵液相對黏稠，溶氧下降的原因。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中復合氮源的比例及含量為胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）=5∶10，變溫點為37 ℃培養(yǎng)7 h后變溫至28 ℃。

3 結(jié)論

通過單因素實驗對初始發(fā)酵培養(yǎng)基的復合氮源比例及含量和變溫發(fā)酵的變溫點進行優(yōu)化，得到最終發(fā)酵培養(yǎng)基組成（g·L-1）：胰蛋白胨5，酵母浸粉10，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5。最終發(fā)酵條件：初始pH 7.0、裝液量50 mL/250 mL、37 ℃培養(yǎng)7 h時變溫至28 ℃培養(yǎng)12 h，發(fā)酵全程搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

采用兩階段控制溫度策略，前期利于菌體生長，后期滿足菌體產(chǎn)素需求，發(fā)酵周期較短。優(yōu)化后的Indigoidine

產(chǎn)量增加了3倍，達到了1.4 g·L-1。

致謝：感謝中國科學院微生物研究所陳義華研究員饋贈含有idgS和sfp基因的pCIMt002質(zhì)粒、感謝天津科技大學生物工程學院謝周杰副研究員在Indigoidine

相關(guān)研究經(jīng)驗的指導，感謝本實驗室唐巧巧同學在重組大腸桿菌工程菌E. coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp構(gòu)建方面的工作。

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