夏瀟瀟, 陳 群, 湛琴琴, 孫 季, 賈彥敦

(1.合肥學(xué)院 生物食品與環(huán)境學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.安徽徽之潤食品股份有限公司,安徽 淮南 237000)

0 引 言

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是一種內(nèi)切酶,可以水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵,將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精、寡糖、葡萄糖和麥芽糖,使淀粉黏度迅速下降,從而實(shí)現(xiàn)淀粉液化[1]。α-淀粉酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中,在制藥、清潔劑生產(chǎn)、釀造、烘焙和造紙等所有以淀粉為基礎(chǔ)的工業(yè)中都具有很廣泛的應(yīng)用[1-4]。

與游離酶相比,固定化酶可以重復(fù)利用,通過底物不斷地參與反應(yīng),可以大大提高催化生產(chǎn)效率[5]。同時(shí),固定化酶具有操作更穩(wěn)定、易于分離和回收、操作可控[6-7]等一系列優(yōu)點(diǎn)。依附于特性良好的固定化材料結(jié)合多種固定化手段是目前酶固定化的常用方法。用于固定化的載體材料需滿足安全性、穩(wěn)定性、親水性、機(jī)械強(qiáng)度、生物相容性和環(huán)境友好性等方面[8-9]的特殊要求,目前使用較多的為無機(jī)材料、有機(jī)材料和高分子材料等[5,10]。隨著綠色化學(xué)的發(fā)展,農(nóng)業(yè)廢棄物作為固定化材料的研究越來越多[5,11-15]。農(nóng)業(yè)廢棄物多富含纖維素和木質(zhì)素等,纖維素具有較強(qiáng)的吸附能力,其結(jié)構(gòu)中的羥基也有利于酶的固定化[5]。文獻(xiàn)[16]使用改性纖維素納米纖維固定漆酶,固定化酶的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性均比游離酶顯著提高,且經(jīng)過5個(gè)催化循環(huán)后,酶活仍達(dá)初始性能的80%。文獻(xiàn)[17]用改性的纖維素固定酪氨酸酶,改性纖維素固定化酪氨酸酶具有良好的貯存穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。

稻殼是稻谷加工的副產(chǎn)物,約含有60%纖維素和15%大小約為50 nm的SiO2。SiO2以無定形狀態(tài)存在于稻殼中,纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等就填充在SiO2的網(wǎng)絡(luò)里[18],因此稻殼具有良好的韌性和多孔性[19-20]。文獻(xiàn)[21]使用稻殼作為載體制作固定化柱進(jìn)行含鎳廢水的處理,結(jié)果表明用稻殼作為載體的反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)間短,對(duì)廢水中的鎳離子去除效果均優(yōu)于礫石和海藻酸鈉氯化鈣。文獻(xiàn)[22]以改性稻殼作為吸附載體,采用“吸附包埋交聯(lián)”的復(fù)合固定化方法制備了白腐真菌固定化生物小球處理廢水,處理后的廢水化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)去除率可達(dá)90.8%。

膨化是一種高溫、高壓、高剪切作用的工藝操作,其瞬間高溫、高壓能夠造成纖維素晶體和纖維束的爆裂,實(shí)現(xiàn)纖維素裂解和疏松[23-24],呈現(xiàn)出更多的片層結(jié)構(gòu),表面積顯著增大。膨化技術(shù)同時(shí)還能夠破壞半纖維素與木質(zhì)素的共價(jià)結(jié)合,切斷氫鍵,使酚羥基、羧基、羥基等大量暴露[24-26]。可見,膨化稻殼具有多孔性、低密度、耐降解、較大的比表面積、富含活性基團(tuán)等優(yōu)勢,且無毒無害、來源廣泛[18,20,24,26],可滿足酶固定化的載體需求。本文以膨化稻殼為載體固定α-淀粉酶,通過優(yōu)化固定化條件,比較酶固定化前后的酶學(xué)性質(zhì),為后期工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

稻殼由安徽省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測站提供;中溫α-淀粉酶購于北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司;氫氧化鈉、葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、3,5-二硝基水楊酸、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、戊二醛、碘化鉀、濃鹽酸、碳酸氫鈉等均購于展望化工試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SX 3000-100擠壓式膨化機(jī)(山東賽信膨化機(jī)械有限公司),SU 8000掃描電子顯微鏡(scanning electronic microscope,SEM)(日本日立公司),FTIR-650傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)(日本島津公司),Tristar Ⅱ 3020 M全自動(dòng)比表面積和孔隙分析儀(美國Micromeritics公司)。

1.3 膨化稻殼的制備

膨化稻殼的制備參考文獻(xiàn)[27]的方法。稻殼用蒸餾水清洗后低溫烘干,粉碎后過20目篩,制成稻殼粉。稱取0.2 kg碳酸氫鈉、0.1 kg碳酸氫銨與0.2 kg水混合均勻,制成助膨劑。將10 kg稻殼粉與0.3 kg助膨劑在攪拌機(jī)內(nèi)混合均勻。預(yù)熱擠壓式膨化機(jī),控制其進(jìn)料溫度為50～100 ℃,出料溫度為110～300 ℃,將上述混合原料放入雙螺桿膨化機(jī)內(nèi)連續(xù)膨化處理。將膨化后的產(chǎn)品粉碎過60目篩,得到膨化稻殼。

1.4 膨化稻殼理化性質(zhì)檢測

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)膨化稻殼的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察;傅里葉紅外光譜儀(FTIR)的掃描區(qū)間為4 000～400 cm-1;使用全自動(dòng)比表面積和孔隙分析儀對(duì)膨化稻殼的比表面積、孔隙率和熱穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。

1.5 α-淀粉酶的固定化

在50 mL燒杯中加入一定量膨化稻殼、2 mL一定質(zhì)量濃度的α-淀粉酶、5 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液和1 mL 2%的羧甲基纖維素鈉,用磁力攪拌器攪拌均勻。攪拌后的混合液用注射器緩慢滴入含2 mL 2%氯化鈣溶液和2 mL一定體積分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液的燒杯中,注射器距液面大約10 cm,全部滴入后,固定化30 min,濾出膠珠,用蒸餾水反復(fù)沖洗,直到上清液中檢測不到游離酶為止,固定化的α-淀粉酶置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

在單因素實(shí)驗(yàn)中分別考察酶質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL)、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%)、膨化稻殼加量(0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g)和戊二醛體積分?jǐn)?shù)(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)的變化對(duì)α-淀粉酶固定化效率的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇對(duì)酶固定化效率影響顯著的因素和水平,進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究,優(yōu)選出α-淀粉酶固定化方案,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.6 酶活測定

α-淀粉酶的酶活力定義:在60 ℃,pH值為6.0時(shí),每反應(yīng)15 min消耗1 mg多糖的酶的量是一個(gè)酶活性單位(U)。

向試管中加入200 μL的2%可溶性淀粉溶液和100 μL pH值為6.0檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液、適當(dāng)稀釋過的2%的待測酶溶液300 μL和蒸餾水400 μL。放入60 ℃的水浴中,靜置15 min,在水浴完成后立即加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液以終止反應(yīng),并從中取1 mL反應(yīng)液置于試管中,再加入1 mL稀碘液,用蒸餾水稀釋至10 mL,在660 nm處測定吸光度。

1.7 酶的固定化效率計(jì)算

酶的固定化效率的計(jì)算公式為：

(1)

1.8 酶學(xué)性質(zhì)研究

對(duì)酶固定化前后的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究?？疾旆磻?yīng)溫度(40、50、60、70、80 ℃)和pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的變化對(duì)酶的影響。分別在60、70、80 ℃下反應(yīng)45 min,比較游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性。將固定化酶連續(xù)反應(yīng)6次,分別測定酶活,考察固定化酶的操作穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 膨化稻殼理化性質(zhì)分析

稻殼膨化前后的SEM和FITR分析如圖1、圖2所示,紅外數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表1所列,稻殼膨化前后的孔容和平均孔徑見表2所列。

由圖1、圖2可知,膨化處理導(dǎo)致稻殼內(nèi)部結(jié)構(gòu)破裂,結(jié)構(gòu)變得松散;稻殼中的纖維素、蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)被破壞,暴露出多個(gè)基團(tuán),特別是—OH、—COO—等活性基團(tuán),可以與酶中游離羧基產(chǎn)生結(jié)合,提高酶的固定化效率。經(jīng)比表面積、孔容和平均孔徑的測定可知,膨化稻殼內(nèi)形成數(shù)量眾多的密集小孔,有利于提高膨化稻殼對(duì)α-淀粉酶的吸附。

圖1 樣品的SEM圖

圖2 樣品的FITR分析

表1 膨化稻殼紅外吸收波數(shù)歸屬

表2 樣品比表面積、孔容和平均孔徑

2.2 α-淀粉酶固定化單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)考察了酶質(zhì)量濃度、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、稻殼加量和戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)α-淀粉酶固定化的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 各因素對(duì)α-淀粉酶固定化的影響

從圖3a可以看出,隨著酶質(zhì)量濃度的上升,相對(duì)酶活不斷上升,但固定效率不斷下降。這是由于酶質(zhì)量濃度越高,酶活越高,但載體容量有限,當(dāng)結(jié)合的酶達(dá)到載體承載的飽和度時(shí),多余的酶分子結(jié)合在一起,擴(kuò)散受阻,導(dǎo)致與底物結(jié)合力下降。

由圖3b～圖3d可知,隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、稻殼加量和戊二醛體積分?jǐn)?shù)的增加,固定化α-淀粉酶的相對(duì)酶活和固定效率均先增大后減小。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí),膠珠難以成型,無法將酶緊密包裹,參與反應(yīng)的酶量少,因此酶活較低;當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高時(shí),過于黏稠導(dǎo)致酶結(jié)合得不夠緊密,也無法達(dá)到良好的固定化效果。膨化稻殼蓬松多孔且含有—COO—和—OH等活性官能團(tuán),能與構(gòu)成酶的氨基酸中的氨基和羧基發(fā)生結(jié)合。但當(dāng)游離酶量過多,會(huì)造成位移阻力妨礙酶和底物結(jié)合,從而導(dǎo)致固定化效果不佳。戊二醛中的醛基可以和酶交聯(lián)結(jié)合,但戊二醛具有一定的毒性,體積分?jǐn)?shù)過高可能使部分酶失活。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),確定最佳固定化條件,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)的因素水平見表3所列,正交試驗(yàn)結(jié)果見表4所列。

表3 正交試驗(yàn)的因素水平

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出,影響固定化酶活的因素從高到低依次為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、戊二醛體積分?jǐn)?shù)、稻殼加量、酶質(zhì)量濃度。同時(shí)得出固定化酶的最優(yōu)方案為:酶質(zhì)量濃度1.0 mg/mL、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%、稻殼含加量0.15 g、戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.4%。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳固定化條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在酶質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%、稻殼加量為0.15 g、戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.4%時(shí),α-淀粉酶的固定化酶效率為95.7%。

2.4 固定化酶的酶學(xué)特性

2.4.1 最適溫度和pH 值

考察反應(yīng)溫度和pH值變化對(duì)游離酶和固定化酶的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 游離酶和固定化酶的最適溫度和pH值

由圖4a可知,游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度分別為60、70 ℃。隨著反應(yīng)溫度的升高,固定化酶活和游離酶活均呈先上升后下降的趨勢,但固定化酶在高溫處比游離酶更能保持高酶活,下降的幅度也沒有游離酶那么迅速。這可能是由于酶被載體緊密結(jié)合,提高了酶對(duì)溫度的耐受性,酶的空間結(jié)構(gòu)得到一定程度保護(hù)。

從圖4b可以看出，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH值都為6.0。但固定化酶的曲線走勢更平穩(wěn),說明固定化酶的pH值穩(wěn)定性更好。這可能是由于酶固定化后,膨化稻殼使酶的微觀環(huán)境發(fā)生變化,酶的帶電性質(zhì)發(fā)生改變。

2.4.2 熱穩(wěn)定性

分別在60、70、80 ℃下反應(yīng)45 min,測定游離酶和固定化酶酶活,計(jì)算相對(duì)酶活的結(jié)果如圖5所示。

圖5 游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性

由圖5可知，隨著溫度的升高,游離酶和固定化酶酶活不斷下降。但相同溫度下,固定化酶的活力一直高于游離酶,這對(duì)于較高溫度下α-淀粉酶的應(yīng)用具有一定意義。

2.4.3 操作穩(wěn)定性

將固定化酶連續(xù)反應(yīng)6次,分別測定酶活,設(shè)定第1次酶活為100%,結(jié)果如圖6所示。

圖6 固定化酶的操作穩(wěn)定性

從圖6可以看出，經(jīng)過6次反應(yīng)后,固定化酶保留53.85%的初始酶活,且前期酶活穩(wěn)定在一個(gè)較高水平。操作5次以后,相對(duì)酶活下降顯著,這可能由于多次操作,導(dǎo)致部分α-淀粉酶與載體結(jié)合不夠緊密,發(fā)生脫落,從而造成酶活降低幅度較大。

3 結(jié) 論

α-淀粉酶是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一。本文將天然稻殼經(jīng)一步膨化處理后,作為α-淀粉酶的固定化載體,建立了α-淀粉酶固定化實(shí)驗(yàn)方案。研究結(jié)果表明:當(dāng)酶質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%、稻殼加量為0.15 g、戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí),固定化酶的固定化效率為95.7%。固定化酶比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性;固定化酶重復(fù)使用6次后,仍保留55.9%的初始酶活。

本文采取膨化技術(shù)處理稻殼粉,方法簡單。處理后的稻殼結(jié)構(gòu)疏松、比表面積增大、活性基團(tuán)大量暴露,為α-淀粉酶的吸附和結(jié)合提供有效條件。使用改性的海南椰衣和改性蔗渣纖維為α-淀粉酶的固定化載體,均獲得良好的固定化效率[28-29]。文獻(xiàn)[28]使用硫酸、高碘酸水解,高碘酸鈉氧化處理海南椰衣；文獻(xiàn)[29]使用氧化劑高碘酸氧化改性蔗渣纖維,改性方法均為化學(xué)法,過程相對(duì)復(fù)雜,使用的試劑危險(xiǎn)性較高。改性后的海南椰衣粗纖維固定化α-淀粉酶的時(shí)間為18 h,耗時(shí)較長[28]。合成材料用于α-淀粉酶的固定化雖然獲得了良好的固定化效率和重復(fù)利用率[30-31],但同樣存在制取載體耗時(shí)、成本高等問題。

綜上所述,與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道相比較,本文在獲得相近的固定化效率和重復(fù)利用率的同時(shí),固定化載體來源廣泛、成本低廉、改性方法簡單、固定化速度快,符合倡導(dǎo)的生態(tài)文明理念和綠色化學(xué)發(fā)展理念,為α-淀粉酶的低成本固定化及農(nóng)業(yè)廢棄物的綜合利用提供了參考。