張 婧，王 玥，李紅霞，林吉柏

(北京穎泰嘉和分析技術(shù)有限公司，北京 102206)

1 概述

農(nóng)藥產(chǎn)品中的活性成分及雜質(zhì)含量是農(nóng)藥登記注冊要求提供的信息。氣相/液相色譜是分析檢測中最常用的分析方法，已廣泛用于農(nóng)藥主成分及其雜質(zhì)的檢驗(yàn)。氣相色譜具有分離能力強(qiáng)、靈敏度高、分析快速等優(yōu)點(diǎn)，但是會(huì)受使用條件的限制，不能直接檢測一些熱穩(wěn)定性較差或高沸點(diǎn)的物質(zhì)，通常需要先把這些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性好或沸點(diǎn)低的衍生物再進(jìn)行檢測。液相色譜檢測常使用反相色譜模式，而一些極性強(qiáng)的化合物如草銨膦、草甘膦等卻無法在反相柱上保留。用親水色譜柱可以分析這些強(qiáng)極性待測物，但親水色譜柱價(jià)格昂貴，因此通常先對化合物進(jìn)行衍生化，再進(jìn)行檢測。此外，農(nóng)藥產(chǎn)品中雜質(zhì)含量一般較低，有的雜質(zhì)分子量較小，也不適合用常規(guī)的色譜分析方法直接測定其含量。也可以通過適當(dāng)?shù)难苌?，提高雜質(zhì)的色譜適用性和靈敏度，從而達(dá)到檢測要求。因此，在農(nóng)藥分析領(lǐng)域中發(fā)展衍生化技術(shù)具有重要的意義。

衍生化方式有柱前衍生、柱上衍生和柱后衍生3種。間接分析法中衍生化試劑的選擇尤為重要，在選擇時(shí)需要綜合考慮以下幾方面的因素：⑴ 衍生試劑必須穩(wěn)定，不與本底發(fā)生反應(yīng)；⑵ 衍生試劑本身和生成的副產(chǎn)物干擾應(yīng)盡可能小，衍生化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率盡可能完全；⑶ 衍生化反應(yīng)條件不能太苛刻，避免高溫高壓等條件；⑷ 試劑安全易獲得，毒性較小。

本文結(jié)合實(shí)例，介紹基于衍生化技術(shù)定量分析吡蚜酮、乙烯利和咪唑乙煙酸3種農(nóng)藥活性成分或其雜質(zhì)的方法。

2 吡蚜酮中雜質(zhì)——水合肼的測定

對于吡蚜酮中雜質(zhì)——水合肼的測定，常采用ZB G14001-90中規(guī)定的方法，即利用水合肼與硫酸生成硫酸肼，在碳酸氫鈉存在下，用碘溶液滴定的方法。此方法工作量大，重現(xiàn)性差，準(zhǔn)確度不高。本文介紹了測定樣品中微量的水合肼的基于衍生化技術(shù)的液相色譜法[1]。

2.1 衍生化方法

本實(shí)驗(yàn)室用過量的五氟苯甲醛(PFB)衍生水合肼，形成吖嗪化合物(PFBA，圖1)。具體為將吡蚜酮樣品溶解于乙腈∶超純水=5∶1(體積比)的混合溶劑中，加入過量的衍生化試劑PFB，充分混合10 min后，用正己烷萃取收集衍生化產(chǎn)物，用GC-ECD檢測分析。

圖1 水合肼衍生化反應(yīng)過程

2.2 儀器條件

安捷倫DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)：起始溫度60 ℃，以40 ℃/min升至100 ℃，再以20 ℃/min升至250 ℃，持續(xù)5 min。流速：1.0 mL/min(恒流)，不分流。進(jìn)樣量：1 μL，進(jìn)樣口溫度：250 ℃，檢測器溫度：300 ℃。

2.3 結(jié)果

衍生化試劑PFB不與主成分吡蚜酮反應(yīng)，過量的PFB與衍生化產(chǎn)物PFBA能夠很好地分離。由于衍生化產(chǎn)物分子中含有10個(gè)氟原子，利用ECD檢測器進(jìn)行分析，可以獲得較好的響應(yīng)。研究獲得的LOD為0.32 ng/mL，定量的下限是36.5 ng/mL(圖2)。此方法適合大多數(shù)農(nóng)藥體系中水合肼的定量。

圖2 36.5 ng/mL衍生化產(chǎn)物PFBA的氣相色譜圖

3 乙烯利主成分及相關(guān)雜質(zhì)MEPHA的定量

乙烯利是一種常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，其不僅自身能釋放出乙烯，而且還能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生乙烯。乙烯利在pH＜3.5水溶液中穩(wěn)定，隨pH升高而水解釋放出乙烯；對紫外光敏感，75 ℃以下穩(wěn)定；沸點(diǎn)約265 ℃(分解)，溶于乙醇、甲醇等極性有機(jī)溶劑。MEPHA是植物生長調(diào)節(jié)劑乙烯利的中間體，也是乙烯利產(chǎn)品中的相關(guān)雜質(zhì)。其沸點(diǎn)124～125 ℃，可在中性至堿性溶液中分解而放出乙烯。MEPHA與乙烯利具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對紫外光及熱不穩(wěn)定。FAO明確要求乙烯利中MEPHA的限值為20 g/kg。

圖3 乙烯利和MEPHA的結(jié)構(gòu)式

關(guān)于乙烯利的分析方法，國際上FAO采用CIPAC方法，即化學(xué)法的酸堿滴定法[2]；我國化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法是將其經(jīng)重氮甲烷酯化，以對硝基苯作內(nèi)標(biāo)，對乙烯利甲酯進(jìn)行氣相色譜法定量分析[3]。重氮甲烷不穩(wěn)定且易爆，實(shí)驗(yàn)室制備及儲(chǔ)存不方便也不安全?！掇r(nóng)藥分析》[4]一書介紹了一種簡單的測定方法即測定乙烯的重量法，但是以上方法的步驟較繁瑣，重現(xiàn)性差、誤差大。本文介紹一種新的衍生化方法，用N,O-雙(三甲基硅基)乙酰胺(BSA)對被試物進(jìn)行甲基化衍生化后，對衍生化產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜法分析。該方法重現(xiàn)性好，靈敏度高，衍生試劑安全易獲得。

3.1 衍生化方法

過量的BSA衍生乙烯利和乙烯利雜質(zhì)MEPHA中的羥基，形成硅甲烷化衍生產(chǎn)物(圖4、圖5)。本實(shí)驗(yàn)室的具體操作為將含乙烯利或MEPHA的樣品溶解于二氯甲烷中，加入過量的衍生化試劑BSA，在(54±2) ℃放置0.5 h，用二氯甲烷定容后用GC-FID檢測分析。

圖4 乙烯利衍生化反應(yīng)過程

圖5 MEPHA衍生化反應(yīng)過程

3.2 儀器條件

3.2.1 測定乙烯利的色譜條件

安捷倫DB-5色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)：起始溫度：100 ℃，持續(xù)1 min，然后以20 ℃/min升溫至250 ℃，持續(xù)1 min。流速：2.0 mL/min(恒流)，進(jìn)樣口溫度：200 ℃，分流比：15∶1，進(jìn)樣量：1 μL，檢測器溫度：280 ℃。乙烯利的衍生化產(chǎn)物的保留時(shí)間為5.0 min。

3.2.2 檢測MEPHA的色譜條件

安捷倫DB-5色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)：起始溫度：80 ℃，持續(xù)1 min，然后以20 ℃/min升溫至280 ℃，持續(xù)1 min。流速：2.0 mL/min(恒流)，進(jìn)樣口溫度：200 ℃，分流比：20∶1，進(jìn)樣量：1 μL，檢測器溫度：280 ℃。MEPHA的衍生化產(chǎn)物的保留時(shí)間為7.0 min。

3.3 結(jié)果

3.3.1 乙烯利的測試結(jié)果

衍生化試劑BSA能夠與乙烯利充分反應(yīng)，用常規(guī)的FID檢測器分析衍生化產(chǎn)物，可以獲得較好的響應(yīng)。線性范圍為767.14～1 203.72 μg/mL(圖6)，線性相關(guān)系數(shù)為：0.999 7，精密度：1.36%，回收率為：(99.94±0.60)%，無基質(zhì)效應(yīng)。衍生化的轉(zhuǎn)化率為：(101.1± 0.75)%。

圖6 767.14 μg/mL乙烯利標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖

3.3.2 MEPHA的測試結(jié)果

衍生化試劑BSA能夠與MEPHA充分反應(yīng)，用常規(guī)的FID檢測器分析衍生化產(chǎn)物，可以獲得較好的響應(yīng)，線性范圍為4.87～79.66 μg/mL(圖7)，線性相關(guān)系數(shù)為：0.999 7，精密度：1.76%，在8.0、50.0、78.5 μg/mL 3個(gè)濃度下的回收率分別為：(120.46±3.69)%、(103.72±1.25)%、(99.68±0.39)%，研究獲得的LOD為2.0 ng/mL，無基質(zhì)效應(yīng)。衍生化的轉(zhuǎn)化率為：(100.4±1.91)%。

圖7 17.70 μg/mL MEPHA標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖

4 咪唑乙煙酸中甲醛的定量

常用的甲醛定量方法是通過對甲醛衍生化后進(jìn)行分光光度法分析[5]，工作量大，不能實(shí)現(xiàn)大批量的智能操作。本文采用甲醛衍生化后液相色譜法，分析周期短，衍生化過程簡單，沒有繁瑣的前處理操作。

4.1 衍生化過程

甲醛在過量銨鹽存在下，與乙酰丙酮反應(yīng)，生成二甲基二乙?；溥拎?DDL)。該化合物在414 nm處有最大吸收，3 h內(nèi)吸光度基本不變。根據(jù)此原理，本實(shí)驗(yàn)室的具體操作為將含醋酸銨的乙酰丙酮溶液置于含甲醛的溶液(乙腈∶超純水=1∶1)中，在(40±2) ℃水浴鍋中加熱15 min，發(fā)生衍生化反應(yīng)(圖6)。衍生化產(chǎn)物DDL經(jīng)由HPLC-DAD分析。

圖8 甲醛衍生化反應(yīng)過程

4.2 儀器條件

安捷倫XDB-C8色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶0.5%HAc=30∶70(體積比)；波長：412 nm。流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，檢測器溫度：30 ℃。運(yùn)行時(shí)間：7 min。

4.3 結(jié)果

衍生化試劑能夠與甲醛充分反應(yīng)，用常規(guī)的DAD檢測器分析衍生化產(chǎn)物，可以獲得較好的響應(yīng)。線性范圍為0.425～3.401 μg/mL (圖9)，線性相關(guān)系數(shù)為：0.999 2，在0.456、0.890、1.707 μg/mL 3個(gè)濃度下的回收率分別為：(109.29±1.23)%、(100.62±0.65)%、(99.61±0.56)%，無基質(zhì)效應(yīng)。衍生化的產(chǎn)率為：(104.66±0.46)%。

圖9 0.850μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)品衍生化后的液相色譜圖

5 結(jié)語

衍生化技術(shù)在農(nóng)藥分析中有著不可或缺的重要作用，通過各種衍生化手段，結(jié)合HPLC和GC等現(xiàn)代分析儀器與各種檢測器(DAD、FID、ECD、MS等)的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了農(nóng)藥分析檢測的高效、快速、高靈敏度、良好的重現(xiàn)性。如何選擇合適的衍生化試劑、優(yōu)化衍生化反應(yīng)條件、簡化衍生化步驟和程序、提高衍生化效率、使衍生產(chǎn)物穩(wěn)定并便于檢測，將是衍生化技術(shù)今后需要進(jìn)一步努力的方向。隨著衍生化試劑的豐富多樣以及衍生化技術(shù)的發(fā)展、分析儀器的進(jìn)步，農(nóng)藥的衍生化分析方法亦將更加靈敏、準(zhǔn)確和可靠，在農(nóng)藥分析檢測領(lǐng)域亦將發(fā)揮更大的作用。