黃碧慧

摘 要：本文建立了一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定膠原蛋白產(chǎn)品中激素的方法。樣品用乙酸乙酯提取，用20%甲醇水進(jìn)行轉(zhuǎn)換溶劑后，用Plexa柱固相萃取柱凈化，甲醇洗脫。以甲醇-水為流動(dòng)相，樣品經(jīng)Kinetex C18柱（150 mm×3 mm，2.6 μm）梯度洗脫分離，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行定性與定量分析。其中孕激素采用正離子掃描方式，雌激素采用負(fù)離子掃描方式，內(nèi)標(biāo)法定量，方法檢出限為0.4～2.0 μg·kg-1。16種激素在高、中、低3個(gè)添加水平下的平均回收率分別為75%～115%，85%～105%，85%～118%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.8%～13.4%、2.3%～10.4%和5.2%～14.0%。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，適用于膠原蛋白產(chǎn)品中16種激素的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;固相萃取;激素;膠原蛋白

Abstract：An UPLC-MS/MS based method for simultaneous determination of estrogen and progesterone in collagen products was developed. Sample was extracted by ethyl acetate， followed by solvent exchange and purification using Plexa SPE column. Further separation of the 16 target compounds was achieved on a Kinetex C18 column （150 mm×3 mm，?2.6 μm） via UPLC by gradient elution with using methanol/water as mobile phase. The analytes were determined qualitatively and quantitatively under the multi-reaction monitoring scan type with tandem mass analyzer， including a positive polarity mode for the progesterone， and a negative polarity mode for the estrogen， respectively. The analysis was performed using internal standards with detection limit of 0.4～ 2.0 μg·kg-1. The recovery of 16 hormones at low， median and high level is 75%～115%， 85%～105% and 85%～118% with relative standard deviation of 3.8%～13.4%， 2.3%～10.4% and 5.2%～14.0%， respectively. The method is simple and sensitive， and can be used for the detection of 16 hormones in collagen products.

Key words：UPLC-MS/MS; SPE; Hormones; Collagen foods

中圖分類號(hào)：O657.63

膠原蛋白在細(xì)胞再生，保證皮膚、骨骼發(fā)揮正常功能中有著重要的作用[1-2]。近年來(lái)，膠原蛋白類產(chǎn)品在市場(chǎng)上備受追捧，消費(fèi)者購(gòu)買需求旺盛，但膠原蛋白的一些負(fù)面報(bào)道也隨之而來(lái)，由于一些激素有防止皮膚老化、除皺、增加皮膚彈性等作用[3-4]，產(chǎn)品中非法添加激素的負(fù)面消息卻不絕于耳。若長(zhǎng)期食用這些激素，可對(duì)人體產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾作用，并影響身體健康。目前，市面上大部分膠原蛋白產(chǎn)品屬于食品中的飲料類、糖果類等，這類食品的監(jiān)管很少涉及激素項(xiàng)目的檢測(cè)，并且也暫無(wú)關(guān)于這類食品中多激素檢測(cè)的相關(guān)方法標(biāo)準(zhǔn)，因此建立一種膠原蛋白產(chǎn)品中多激素的檢測(cè)方法顯得十分必要。

膠原蛋白產(chǎn)品中含豐富的蛋白、糖等基質(zhì)，在檢測(cè)過(guò)程中必然存在基質(zhì)效應(yīng)（ME）的問(wèn)題，增加了多激素凈化和檢測(cè)的難度。目前，多激素檢測(cè)普遍采用的方法有氣質(zhì)聯(lián)用法[5-7]、液相色譜法[8-10]和液質(zhì)聯(lián)用法[11-15]，其中液質(zhì)聯(lián)用法因其高穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單不需要衍生等特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于各種化合物的檢測(cè)中。本研究建立了同位素內(nèi)標(biāo)-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀膠原蛋白產(chǎn)品中7種雌激素（雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚）、9種孕激素（炔諾酮、21α-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、孕酮和甲羥孕酮乙酸酯）的測(cè)定分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)各類激素的快速準(zhǔn)確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備、試劑與耗材

API 5500Q Trap型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）;1290超高壓液相色譜分離系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司）;20通道固相萃取裝置（美國(guó)安捷倫公司）;MS2旋渦混勻器（德國(guó)IKA有限公司）;CF15RN高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）;MV5氮吹濃縮儀（美國(guó)LabTech公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfe，包括雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、己二烯雌酚、炔諾酮、21α-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、孕酮和甲羥孕酮乙酸酯（純度>97%）共16種激素。以甲醇為溶劑配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃儲(chǔ)存。臨用時(shí)根據(jù)需要配制所需的濃度。

11種激素內(nèi)標(biāo)，分別為炔諾孕酮-D6、孕酮-D9、甲地孕酮乙酸酯-D3、甲羥孕酮-D3、美侖孕酮-D2、炔諾酮-13C2、雌酮-D2、雌二醇-13C2、己烯雌酚-D8、己二烯雌酚-D2和己烷雌酚-D4（純度>97%）。以甲醇為溶劑配制成質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃儲(chǔ)存。

乙酸乙酯、甲醇，均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)默克公司;實(shí)驗(yàn)用水為自制Mill-Q超純水。

固相萃取柱：Bond Elut Plexa柱（3 mL/60 mg，Agilent公司）。液相色譜柱Kinetex C18（150 mm×3 mm， 2.6 μm，美國(guó)Phenomenex公司）。

實(shí)驗(yàn)用的膠原蛋白類食品于網(wǎng)絡(luò)上采購(gòu)收集，包括膠原蛋白糖果、膠原蛋白固體飲料和膠原蛋白飲品3種類型產(chǎn)品。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品的制備

取多個(gè)預(yù)包裝的樣品直接混合均勻，膠原蛋白糖果樣品充分粉碎并攪拌均勻。取其中的200 g裝入玻璃容器中，密封，試樣于4 ℃保存。

1.2.2 樣品的提取

稱?。?±0.01）g制備后的樣品于50 mL聚乙烯離心管中，其中糖果與固體飲料需加入少量水（視情況而定）至樣品溶解，而液體飲品不需要加水，然后加入5 mL乙酸乙酯溶液，2 000 r·min-1渦旋混合1 min，在4 ℃，12 000 r·min-1離心3 min，重復(fù)提取2次，合并上清液。

1.2.3 樣品的凈化

將上清液氮吹至近干后，加入2 mL，20%甲醇水（v∶v）復(fù)溶，渦旋混勻，待凈化過(guò)柱。加入依次以6 mL甲醇和6 mL水活化的Plexa小柱，以1滴/s的速度過(guò)柱，棄去流出液，再用6 mL 25%的甲醇水（v∶v）進(jìn)行淋洗，抽干，最后用8 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液在40℃氮吹濃縮至近干，用1.0 mL，20%甲醇水（v∶v）溶液復(fù)溶，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

柱溫：35 ℃，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量：2.0 μL。流動(dòng)相：10%甲醇水（v：v）（A1）和甲醇（B1）;梯度洗脫程序：0～1 min，40% B1;1～6 min，40%～60% B1;6～9 min，60%～90% B1;9～10 min，90% B1;10.1～15 min，40% B1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源;掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè);氣簾氣壓（CUR）：25 MPa;電噴霧電壓（IS）：5 500 V;離子化溫度（TEM）：550 ℃;霧化氣壓力（GS1）：50 MPa;干燥氣壓力（GS2）：50 MPa。目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)定性、定量離子對(duì)，去簇電壓（DP）及碰撞電壓（CE）見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)中的化合物屬于非極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶的原理，提取溶劑也應(yīng)選用非極性溶劑，乙酸乙酯作為非極性物質(zhì)提取溶劑有著不可取代的優(yōu)勢(shì)，尤其在處理含有大量水分的液體樣品，與乙腈、甲醇等與水能互溶的提取溶劑相比，前處理還能減少繁瑣的除去樣品中水分的步驟，實(shí)現(xiàn)快速提取測(cè)定的目的，因此本文選擇乙酸乙酯作為實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。另外，由于固體樣品不溶于乙酸乙酯，為了使樣品提取更完全，在處理固體樣品時(shí)，先加少部分水，將樣品溶解后，再加適量的乙酸乙酯提取。

2.1.2 凈化方法的優(yōu)化

16種化合物結(jié)構(gòu)中沒有銨鹽、羧酸官能團(tuán)，因此不適宜選擇用離子交換柱作為凈化樣品的固相萃取柱。Plexa柱是一種非極性二乙烯基苯基的中性聚合物吸附劑，可以利用其非極性保留機(jī)理凈化樣品。同時(shí)為了在上樣過(guò)程中能更好地在柱上有保留，在用乙酸乙酯提取完成后，要先進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換。復(fù)溶溶劑為一定濃度的甲醇水溶液，復(fù)溶溶劑中甲醇的含量不能過(guò)高，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致上樣時(shí)目標(biāo)化合物在固相萃取柱的不保留，過(guò)低不利于非極性目標(biāo)物的溶解。本實(shí)驗(yàn)考察了不同體積分?jǐn)?shù)比的甲醇水溶液作為上樣溶劑時(shí)的處理效果。不同復(fù)溶溶劑濃度下高回收率的化合物數(shù)目如圖1所示，結(jié)果表明甲醇體積比在20%時(shí)，所有目標(biāo)化合物的回收率能達(dá)到90%以上。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究采用了Phenomenex的Kinetex C18液相色譜柱，能有效分離16種激素化合物。質(zhì)譜采集采用了正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)的MRM模式，因此在選擇流動(dòng)相體系時(shí)，應(yīng)同時(shí)兼顧正負(fù)離子模式下的離子化效率，讓各化合物都能達(dá)到良好的響應(yīng)。本研究考察了在乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨、甲醇-水3種流動(dòng)相體系下目標(biāo)化合物的靈敏度和重現(xiàn)性，結(jié)果表明：正離子采集模式下的孕激素在乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-水流動(dòng)相體系下的響應(yīng)值接近，都比在乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨體系下的響應(yīng)值高。但孕激素在乙腈-0.1%甲酸水體系下的噪音強(qiáng)，基線高;在另外兩個(gè)體系下的基線低，性噪比高。負(fù)離子采集模式下的雌激素在乙腈-0.1%甲酸水體系下雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮無(wú)響應(yīng)，其余化合物響應(yīng)也不高;在乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨體系下響應(yīng)次之;在甲醇-水體系中的響應(yīng)最高，峰形好、性噪比最高。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇甲醇-水為分析流動(dòng)相。16種激素定量離子MRM色譜圖見圖2。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用大氣壓電噴霧離子源，正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)模式對(duì)16種激素進(jìn)行測(cè)定，采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣方式，將16種激素標(biāo)準(zhǔn)溶液（其中炔雌醇、雌二醇、雌三醇濃度為200 ng·mL-1，其余各激素為100 ng·mL-1）分別注入質(zhì)譜中。先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到各自的母離子。再對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到物質(zhì)的子離子信息，最后通過(guò)優(yōu)化各物質(zhì)的去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），確定各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜法中普遍存在，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精密度。因此在高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法開發(fā)和驗(yàn)證過(guò)程中需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)[16]。本文分別采用甲醇和膠原蛋白飲品空白基質(zhì)液配制激素的混標(biāo)溶液，其中炔雌醇、雌二醇、雌三醇濃度為20 ng·mL-1，其余激素濃度為10 ng·mL-1。分別上機(jī)測(cè)定，比較在沒有基質(zhì)和有基質(zhì)的條件下，各激素的響應(yīng)值變化?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算方法見公式（1）。

由測(cè)定結(jié)果可知，正離子模式采集下的孕激素基質(zhì)效應(yīng)不是很明顯，只有炔諾酮和甲基炔諾酮有略微的抑制效應(yīng)，抑制率在60%～70%。但負(fù)離子模式下采集的雌激素全都有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，增強(qiáng)率在110%～150%。基質(zhì)效應(yīng)的存在，影響了目標(biāo)物的測(cè)定結(jié)果。由于內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)化合物有相同的化學(xué)性質(zhì)，在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中能有相似的響應(yīng)行為，因此采用內(nèi)標(biāo)法定量最能有效的消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.4.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

實(shí)驗(yàn)本著盡量選擇與目標(biāo)物相對(duì)應(yīng)的同位素化合物作為內(nèi)標(biāo)物的原則，對(duì)16種性激素進(jìn)行定量。但仍有部分化合物（如21α-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、乙酸氯地孕酮、甲羥孕酮乙酸酯、炔雌醇、雌三醇）無(wú)相應(yīng)的同位素化合物。因此，為了達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的，通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)數(shù)據(jù)，選擇出峰時(shí)間接近、并與目標(biāo)化合物有相應(yīng)響應(yīng)行為的同位素化合物作為其定量采用的內(nèi)標(biāo)物?；衔飳?duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物見表1。

2.4.3 線性范圍、檢出限

本研究采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析。配制系列梯度水平的目標(biāo)物溶液，內(nèi)含相同濃度的內(nèi)標(biāo)液（除雌二醇-13C2濃度為10.0 ng·mL-1外，其余內(nèi)標(biāo)濃度為5.0 ng·mL-1）作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，以各化合物濃度與相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以最低濃度響應(yīng)的3 倍信噪比（S/N≥3）對(duì)應(yīng)的濃度作為檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）對(duì)應(yīng)的濃度作為定量限（LOQ）。結(jié)果見表2。從表2可以看出，16種化合物在一定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.99以上。

2.4.4 回收率和精密度

按照2.2節(jié)的前處理方法分別選取膠原蛋白飲品、膠原蛋白固體飲料、膠原蛋白糖果空白樣品為測(cè)試對(duì)象，考察了3類樣品高、中、低（2 μg·kg-1、10 μg·kg-1、20 μg·kg-1）3個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次。求出各化合物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。測(cè)定結(jié)果顯示：在膠原蛋白飲品、膠原蛋白固體飲料、膠原蛋白糖果樣品中，16種激素在2 μg·kg-1加標(biāo)水平時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～13.4%，平均回收率為75%～115%;在10 μg·kg-1加標(biāo)水平時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～10.4%，平均回收率為85%～105%;在20 μg·kg-1加標(biāo)水平時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～14.0%，平均回收率為85%～118%。方法準(zhǔn)確度和精密度均滿足檢測(cè)的要求。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

運(yùn)用本研究建立的方法對(duì)市售膠原蛋白飲品、膠原蛋白固體飲料、膠原蛋白糖果10份樣品進(jìn)行16種激素的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示未見有目標(biāo)激素檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了同位素稀釋-固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定膠原蛋白食品中16種激素的檢測(cè)分析方法，該方法具有簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn)。使用乙酸乙酯作為提取溶劑，固相萃取法凈化，同時(shí)利用同位素內(nèi)標(biāo)消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，使樣品前處理方法適合不同類型的膠原蛋白產(chǎn)品。選擇合適的正負(fù)離子同時(shí)采集的流動(dòng)相體系，實(shí)現(xiàn)一次上機(jī)完成16種激素同時(shí)測(cè)定的目的。

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