李社增，牛露欣，李博超，陳秀葉，劉暢，鹿秀云，郭慶港，馬平*，馬峙英

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 教育部華北作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定071000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/ 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071000；3.南加州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，美國(guó) 洛杉磯90089；4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京210095）

棉花（Gossypium spp.）作為世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一和紡織工業(yè)天然纖維的主要來源，在世界30 多個(gè)國(guó)家均有種植， 已成為許多發(fā)展中國(guó)家的經(jīng)濟(jì)支柱[1]。 陸地棉（G.hirsutum）因其產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)好，是世界上栽培最廣泛的棉種，占世界棉花種植面積的92%～95%[2]。 在陸地棉上，由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黃萎病是1 種嚴(yán)重的土傳真菌病害，每年給棉花生產(chǎn)造成巨大損失[3-6]。 許多學(xué)者認(rèn)為，種植抗黃萎病棉花品種是防治黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的措施[7-8]；但由于缺乏抗源材料，抗病棉花育種工作受到極大限制[9]。 自1974 年在海島棉（G.barbadense） 中發(fā)現(xiàn)對(duì)黃萎病高抗性基因后[10]，近50 年來，通過遠(yuǎn)緣雜交、傳統(tǒng)棉花育種等方法，在改善陸地棉對(duì)黃萎病的抗性方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[11-13]。 同時(shí)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，棉花分子育種研究越來越受到科學(xué)家的重視，通過導(dǎo)入外源抗病基因或改造調(diào)控基因提高了陸地棉對(duì)黃萎病的抗性[14-17]。 盡管在通過傳統(tǒng)育種和分子育種提高棉花抗病性方面取得了重要進(jìn)展，但這些相關(guān)技術(shù)和抗性資源材料仍不能滿足棉花生產(chǎn)的需求。

為了加速棉花抗病分子育種， 在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組水平進(jìn)一步解析棉花抗黃萎病機(jī)制是非常必要的。 近幾十年來，棉花防御大麗輪枝菌的機(jī)制研究取得了一些進(jìn)展。 例如，棉花的防御機(jī)制主要依賴于預(yù)先形成的防御結(jié)構(gòu)（厚角質(zhì)層）和酚類化合物的合成來阻止病原菌的侵入，并通過加強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，釋放植保素（黃酮類、酚類和倍半萜類）[18-19]、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白[20]和苯丙酸等物質(zhì)[21]，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累[22-23]和系統(tǒng)獲得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）[24]等特殊抗性反應(yīng)阻止或延緩病原菌在棉花植株內(nèi)的擴(kuò)展。 然而，棉花對(duì)大麗輪枝菌的這些防御機(jī)制研究成果仍然不足以用于提高棉花抗病育種的效率[25]。因此，在不同組學(xué)水平上研究棉花對(duì)大麗輪枝菌的防御機(jī)制，挖掘多種與棉花抗病性相關(guān)的物質(zhì)，對(duì)改進(jìn)棉花抗病育種策略具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)所有代謝產(chǎn)物組成的分析。 對(duì)生物體完整代謝組學(xué)的研究可進(jìn)一步解釋轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的最終結(jié)果，且代謝組的變化將為相應(yīng)基因表達(dá)的潛在變化提供有力證據(jù)[26]。因此，研究大麗輪枝菌與棉花互作過程中代謝組的動(dòng)態(tài)變化，有助于分析代謝途徑，解析代謝產(chǎn)物的生物學(xué)作用。 在代謝組分析中，明確代謝產(chǎn)物的種類尤為重要。 然而，由于代謝物的化學(xué)種類繁多且含量變化范圍大，缺乏能夠同時(shí)分離和檢測(cè)所有代謝物的單一分析方法，完整代謝組的分析需要不同的互補(bǔ)分析技術(shù)， 所以建立高效的分析方法是代謝組分析中1 項(xiàng)具有技術(shù)挑戰(zhàn)性的工作。 自從一些科學(xué)家通過氣相色譜-質(zhì)譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）[27-28]或液相色譜- 質(zhì)譜（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[29-30]完成對(duì)擬南芥、番茄等植物提取物分析后，色譜與質(zhì)譜相結(jié)合的綜合分析技術(shù)被證明對(duì)代謝組分析而言是1種高效的和最靈敏的方法。

本研究利用超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜（Ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry，UPLC-ESIMS）方法，著重針對(duì)大麗輪枝菌- 陸地棉互作過程中次生代謝產(chǎn)物開展研究，在代謝組學(xué)水平上揭示病原菌與棉花互作過程中棉花次生代謝產(chǎn)物變化情況， 旨在豐富棉花代謝組學(xué)研究數(shù)據(jù)，為通過病程相關(guān)次生代謝產(chǎn)物揭示棉花抗病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步基于分子調(diào)控技術(shù)的抗病棉花品種高效選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棉花育苗與樣品材料準(zhǔn)備

1.1.1 棉花育苗。 將土和草炭按質(zhì)量比2∶1 混勻作為育苗基質(zhì)，121 ℃間歇滅菌2 次，每次1 h，間隔時(shí)間1 d。供試棉花品種為中棉所24（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李付廣博士提供）， 為早熟棉，纖維品質(zhì)優(yōu)良，在田間人工棉花黃萎病病圃（土壤中優(yōu)勢(shì)病原菌為大麗輪枝菌WX-1 菌株）抗病性鑒定試驗(yàn)中，2 年均表現(xiàn)為感病。棉花種子用10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）漂白粉消毒液與95%（體積分?jǐn)?shù)）酒精的混合液（體積比1∶1）消毒5 min，用無菌水沖洗3 次后，播種于盛有育苗基質(zhì)的書式育苗盒（長(zhǎng)37 cm，寬22 cm，高15 cm）中，每個(gè)育苗盒共有32 個(gè)育苗孔，每孔播種2 粒種子。 將育苗盒置于25～30 ℃的溫室中進(jìn)行育苗， 根據(jù)棉花需求適當(dāng)澆水。 棉苗出齊后，每個(gè)育苗孔中僅留健康棉苗1 棵。

1.1.2 病原菌接種液制備。 選用大麗輪枝菌WX-1 菌株（強(qiáng)致病力，分離自河北省威縣棉花病株，由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存）作為本研究的病原菌。 先將該菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （Potato dextrose agar，PDA） 平板培養(yǎng)基上25 ℃下培養(yǎng)7～10 d。 在菌落邊緣區(qū)域，用直徑3 mm 無菌打孔器將其菌落制成菌片，將4～5 片菌片加到盛有100mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液 （Potato dextrose broth，PDB）的三角瓶（300 mL）中，在25 ℃、160 r·min－1條件下振蕩培養(yǎng)7 d。 然后用4 層無菌紗布過濾，制得病原菌分生孢子懸浮液，應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)其中病原菌分生孢子含量，并用無菌水將其制成分生孢子含量為107mL－1的懸浮液，作為病原菌接種液。

1.1.3 病原菌接種。 當(dāng)棉苗生長(zhǎng)到2 片真葉時(shí)，采用傷根接種法進(jìn)行病原菌接種。 具體方法如下：將棉苗自育苗盒取出，用無菌剪刀在距根尖1.5 cm 處剪斷棉根，再放回育苗盒。 將盛有傷根棉苗的育苗盒浸泡在盛有2 L 病原菌接種液的塑料盒（長(zhǎng)40 cm，寬24 cm，深25 cm）中30 min，然后將育苗盒仍放回原來育苗環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。 同時(shí)傷根棉苗在無菌水中浸泡30 min 作為健康對(duì)照處理。 每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)1 個(gè)育苗盒，每盒32 棵棉苗。

1.1.4 棉花取樣與處理。 Daayf 等[31]研究證明棉花在傷根接種病原菌7 d 時(shí)，莖部出現(xiàn)癥狀，表明病原菌與棉花發(fā)生了充分互作。 因此，本研究于病原菌接種后8 d 時(shí)，分別收集棉苗根、莖、葉的組織材料， 應(yīng)用液氮冷凍干燥后用植物粉碎機(jī)（Scientz-48，北京同元聚物科技有限公司）研磨成粉末，并保存在－80 ℃冰箱中備用。

1.2 棉苗組織中代謝物提取

稱取冷凍棉花組織粉末樣品100 mg，在室溫下解凍15 min，加入800 μL 溶劑[高效液相色譜（HPLC）級(jí)甲醇∶蒸餾水＝7∶3（體積比），甲醇購(gòu)自Merck KGaA 公司]， 研磨1 min， 超聲提取30 min，靜置5 min，在12 000 r·min－1（4 ℃）下離心10 min， 取上清液100 μL 置于進(jìn)樣小瓶中，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)

應(yīng)用超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜儀（UPLCESI-MS）對(duì)棉苗組織提取物進(jìn)行分析。 UPLC 儀為SHIMADZU LC-30 AD， 由日本Shimadzu 公司生產(chǎn)； 質(zhì)譜儀為AB Triple TOF TM5600 system-MS/MS，由美國(guó)AB SCIEX 公司生產(chǎn)。

色譜條件： 色譜柱為Shim-pack GIST C18（直徑2.1 mm，長(zhǎng)100 mm，填料粒徑2 μm），流動(dòng)相A 相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，流動(dòng)相B 相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸乙腈溶液，流速0.35 mL·min－1，柱溫40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃，進(jìn)樣量4 μL。 每個(gè)樣品3 次重復(fù)。 洗脫條件：0～1.0 min，5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）B；1.0～6.0 min，5%～20%B；6.0～9.0 min，20%～50%B；9.0～13.0 min，50%～95% B；13.0 ～15.0 min，95%B；15.0～15.2 min，95%～5% B；15.2～17.5 min，5%B。

正離子模式（Positive mode，ESI＋）質(zhì)譜檢測(cè)：噴霧氣壓（GAS1）344.7 kPa（50 psi），輔助加熱氣壓（GAS2）413.7 kPa（60 psi），輔 助 加 熱 氣 溫 度500 ℃，氣簾氣壓（CUR）241.3 kPa（35 psi），離子化電壓（IS）5 500 V，采集模式為信息依賴型采集（IDA）模式，飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS）質(zhì) 荷比（m/z） 掃描范圍50～1 500， 累積時(shí)間250 ms，TOF-MS/MS 二級(jí)m/z 掃描范圍50～1 000，累積時(shí)間50 ms，去簇電壓（DP）100 V，碰撞能量（CE）35 eV，擴(kuò)展碰撞能量（CES）15 eV。

負(fù)離子模式（Negative mode，ESI－）質(zhì)譜檢測(cè)：輔助加熱氣壓379.2 kPa（55 psi），氣簾氣壓172.4 kPa（25 psi），離子化電壓4 500 V，其他參數(shù)設(shè)置均與正離子模式質(zhì)譜檢測(cè)一致。

應(yīng)用甲酸鈉的相對(duì)分子質(zhì)量作為鎖定的相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性進(jìn)行校正，每6 個(gè)樣品自動(dòng)校正1 次。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理和分析

采用在線XCMS 軟件對(duì)UPLC-ESI-MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化和手工處理（https://xcmsonline.scripps.edu）[32]，進(jìn)行特征離子峰提取、峰對(duì)齊、色譜峰識(shí)別及峰匹配，獲得質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間（Retention time，RT）和峰強(qiáng)度（Peak intensity）等數(shù)據(jù)， 進(jìn)一步將RT、m/z 和峰強(qiáng)度等數(shù)據(jù)導(dǎo)出為.xlsx 文件，在MS Excel 2010 軟件中手動(dòng)搜索和編輯，包括雜質(zhì)峰的消除和數(shù)據(jù)去噪。 將最終結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣（RT×m/z×峰強(qiáng)度），構(gòu)建ESI＋和ESI－變量的2 個(gè)數(shù)據(jù)集，并用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。

采用SIMCA 14.1 軟件（MKS Umetrics AB）和MS Excel 2010 軟件對(duì)上述2 組數(shù)據(jù)集進(jìn)行單因子和多元統(tǒng)計(jì)分析。 在SIMCA 14.1 軟件中數(shù)據(jù)均采用Pareto scaling 標(biāo)準(zhǔn)處理。首先進(jìn)行無監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析——主成分分析（Principal components analysis，PCA）， 觀察各組數(shù)據(jù)的聚類并去除離群樣本；然后采用正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA） 進(jìn)行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析， 采用200 次置換檢驗(yàn)防止OPLS-DA 模型的過度擬合， 進(jìn)一步通過S-Plot 和模型參數(shù)R2X、R2Y、Q2評(píng)價(jià)OPLS-DA 模型的有效性， 計(jì)算變量的重要性值（VIP 值）。 應(yīng)用MS Excel 軟件t 檢驗(yàn)，分析病原菌處理的特征離子峰強(qiáng)度與相應(yīng)健康對(duì)照間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.5 病原菌- 棉花互作過程中重要次生代謝產(chǎn)物挖掘

根據(jù)OPLS-DA 模型的VIP 值（VIP 值＞1）、病原菌處理后棉花次生代謝產(chǎn)物的特征離子峰強(qiáng)度與相應(yīng)健康對(duì)照間t 檢驗(yàn)的p 值（p＜0.05）及峰強(qiáng)度變化，分析病原菌處理與健康對(duì)照間棉花次生代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，篩選與棉花黃萎病病程相關(guān)的重要次生代謝產(chǎn)物。

1.6 重要次生代謝產(chǎn)物鑒定

首先， 根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料和在線數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得已報(bào)道的有關(guān)棉花代謝產(chǎn)物信息并建立自有數(shù)據(jù)庫(kù)。這些信息包括代謝產(chǎn)物名稱、CAS 號(hào)、分子式、單同位素準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量、信息來源。其次， 根據(jù)ESI＋和ESI－檢測(cè)中加合物存在的一般規(guī)律[33]，利用Matlab 軟件（Version 2018b，MathWorks,Inc.）編制計(jì)算程序（暫不公開），根據(jù)每個(gè)特征離子的m/z 計(jì)算出對(duì)應(yīng)的所有可能的準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)一步計(jì)算與自建棉花代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)的各物質(zhì)準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量間的誤差，根據(jù)鎖定的相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)誤差設(shè)定誤差閾值，以小于此閾值推定的匹配物質(zhì)作為供試代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 目前明確的棉花代謝產(chǎn)物信息

基于文獻(xiàn)和在線代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)，收集了有關(guān)棉花的代謝產(chǎn)物信息， 涵蓋亞洲棉 （G. arboreum）、海島棉（G.barbadense）、陸地棉（G.hirsutum）、草棉（G.herbaceum）和南岱華棉（G.sturtianum var.nandewarense）5 個(gè)種。 這些代謝產(chǎn)物屬于極性、半極性和非極性化合物。 由于本研究用于植物代謝產(chǎn)物提取、分離和檢測(cè)的程序偏向于半極性化合物，預(yù)期包括酚類、萜類、生物堿及其衍生物等次生代謝物將被檢測(cè)到。 迄今為止，自棉花根、莖、葉、花和種子提取物中分離和檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物有111 種，包括萜類化合物61 種、酚類化合物6 種、黃酮類化合物26 種、生物堿6種、脂肪族天然產(chǎn)物6 種、碳水化合物5 種和簡(jiǎn)單芳香族天然產(chǎn)物1 種（附表1，印刷版省略，電子版參見本刊網(wǎng)站）。

2.2 棉苗組織的代謝譜

棉花根、莖、葉各組織的70%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇/ 水提取物能夠通過UPLC-ESI-MS 進(jìn)行分析，圖1 為棉花根樣本中代謝產(chǎn)物在正、負(fù)離子模式下UPLC-ESI-MS 總離子色譜圖。 應(yīng)用在線XCMS 軟件分別對(duì)正離子模式和負(fù)離子模式下采集的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，導(dǎo)出到.xlsx 文件中構(gòu)建了2 個(gè)數(shù)據(jù)集（正離子代謝組數(shù)據(jù)和負(fù)離子代謝組數(shù)據(jù)），正離子模式檢測(cè)獲得4 572 個(gè)離子峰（ESI＋離子），負(fù)離子模式檢測(cè)獲得3 960個(gè)離子峰（ESI－離子），導(dǎo)出的數(shù)據(jù)中包含了各離子的RT、m/z 和峰強(qiáng)度。 ESI＋和ESI－離子的RT分別為0.14～17.39 min 和0.15～17.28 min，m/z分別為49.999 14～999.290 865 和61.990 806～1 497.974 607。 同時(shí)，根樣本總離子圖顯示，棉花中常見代謝產(chǎn)物棉酚在2 個(gè)模式中保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均有所不同：在正離子模式下，棉酚的保留時(shí)間為14.32～14.37 min （圖1A）， 峰面積為4.5×105；負(fù)離子模式下，其保留時(shí)間為14.56～14.71 min（圖1B），峰面積為1.4×106。 圖1A 還顯示了正離子模式下棉酚在保留時(shí)間為14.352 min時(shí)，其加合物[M＋H]＋的質(zhì)荷比（m/z 519.202 4）、峰強(qiáng)度及相應(yīng)MS/MS 光譜；圖1B 還顯示了負(fù)離子模式下棉酚在保留時(shí)間為14.646 min 時(shí)其加合物[M－H]－的質(zhì)荷比（m/z 517.185 6）、峰強(qiáng)度及相應(yīng)MS/MS 光譜。

圖1 正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）下棉花根樣本中代謝產(chǎn)物UPLC-ESI-MS 總離子色譜圖Fig. 1 UPLC-ESI-MS TICs of metabolites occurring in cotton root under positive (A) and negative (B)ionization modes

2.3 代謝組數(shù)據(jù)有效性和可靠性

對(duì)2 個(gè)數(shù)據(jù)集的主成分分析結(jié)果（圖2A、圖3A） 顯示， 樣本數(shù)據(jù)都處于95%置信區(qū)間內(nèi)，但根、莖、葉3 個(gè)組織能夠明顯獨(dú)立分開，并且同一棉花組織近距離聚集；同時(shí)病原菌處理的棉花組織與相應(yīng)健康對(duì)照也呈現(xiàn)明顯分離趨勢(shì)，同一處理能近距離聚集。 初步說明獲得數(shù)據(jù)有效可信，植物組織間及不同處理間存在差異。

圖2 正離子模式下根、莖、葉樣本的主成分分析模型和正交偏最小二乘法判別分析模型Fig. 2 PCA model and OPLS-DA model of root, stem and leaf under positive ionization modes

圖3 負(fù)離子模式下根、莖、葉樣本的主成分分析模型和正交偏最小二乘法判別分析模型Fig. 3 PCA model and OPLS-DA model of root, stem and leaf under negative ionization modes

進(jìn)一步采用OPLS-DA 法對(duì)不同組織樣本分析，結(jié)果表明供試樣本數(shù)據(jù)均處于95%置信區(qū)間內(nèi)，同一組織樣本數(shù)據(jù)在病原菌處理與相應(yīng)健康對(duì)照間存在明顯的分離趨勢(shì)，同一處理樣本近距離聚集（圖2B～D、圖3B～D），而且對(duì)OPLS-DA的置換檢驗(yàn)表明建立的OPLS-DA 模型沒有過度擬合（圖2E～G、圖3E～G）。 并且無論正離子模式下，還是負(fù)離子模式下，根、莖、葉3 個(gè)棉花組織的OPLS-DA 模型參數(shù)R2Y 均不低于0.995，Q2均不低于0.727（圖2H 和圖3H），說明建立的OPLS-DA 模型有效和可靠。 上述結(jié)果表明同一組織不同處理間存在明顯的差異。

2.4 與大麗輪枝菌侵染相關(guān)的棉花代謝產(chǎn)物挖掘

2.4.1 大麗輪枝菌處理與健康對(duì)照間棉花差異代謝產(chǎn)物。 棉花根、莖、葉樣本中代謝產(chǎn)物的OPLS-DA S-plot 結(jié)果（圖4）表明，檢測(cè)到的棉花代謝產(chǎn)物離子在模型中呈現(xiàn)S 型分布，說明同一棉花組織不同處理間部分代謝產(chǎn)物存在明顯差異。根據(jù)OPLS-DA 模型計(jì)算的各離子VIP 值和不同處理間學(xué)生t 檢驗(yàn)p 值進(jìn)行了差異棉花代謝產(chǎn)物篩選，989 個(gè)離子的VIP＞1 和p＜0.05，其中正離子模式下檢測(cè)到131 個(gè)離子（ESI＋離子），負(fù)離子模式下檢測(cè)到858 個(gè)離子（ESI－離子）。 這989 個(gè)差異代謝產(chǎn)物中，59 個(gè)ESI＋離子和441 個(gè)ESI－離子存在于棉花根中，41 個(gè)ESI＋離子和323 個(gè)ESI－離子存在于棉花莖中，48 個(gè)ESI＋離子和342個(gè)ESI－離子存在于棉花葉片中（圖5），其中9 個(gè)ESI＋離子和40 個(gè)ESI－離子同時(shí)存在于3 個(gè)棉花組織中。

圖4 正、負(fù)離子模式下棉花根、莖、葉樣本中代謝產(chǎn)物的OPLS-DA S-plot 圖Fig. 4 OPLS-DA S-plots of metabolites presenting in root, stem and leaf under positive and negative ionization modes

圖5 病原菌處理與健康對(duì)照間差異離子在不同棉花組織中分布情況Fig. 5 Distribution of differential ions between pathogen-treated tissues and healthy controls in different cotton tissues

2.4.2 與大麗輪枝菌侵染相關(guān)的重要棉花代謝產(chǎn)物。在上述989 個(gè)差異代謝產(chǎn)物離子中，576 個(gè)離子（82 個(gè)ESI＋離子和494 個(gè)ESI－離子）的峰強(qiáng)度在病原菌處理下較對(duì)照增加1 倍及以上或降低50%及以上（圖6），詳細(xì)離子信息列于附表2和附表3（印刷版省略，電子版參見本刊網(wǎng)站）。在這576 個(gè)顯著變化離子中，461 個(gè)離子（33 個(gè)ESI＋離子和428 個(gè)ESI－離子）出現(xiàn)在棉花根部，77 個(gè)離子（20 個(gè)ESI＋離子和57 個(gè)ESI－離子）出現(xiàn)在莖部，72 個(gè)離子（34 個(gè)ESI＋離子和38 個(gè)ESI－離子）出現(xiàn)在葉部，其中僅有2 個(gè)ESI－同時(shí)出現(xiàn)在棉花根、莖、葉3 個(gè)棉花組織中。

與對(duì)照相比，病原菌處理的根部出現(xiàn)376 個(gè)離子（27 個(gè)ESI＋和349 個(gè)ESI－）的峰強(qiáng)度增加1倍及以上和85 個(gè)離子 （6 個(gè)ESI＋離子和79 個(gè)ESI－離子）的峰強(qiáng)度降低50%及以上，莖部出現(xiàn)49 個(gè)離子（11 個(gè)ESI＋離子和38 個(gè)ESI－離子）峰強(qiáng)度增加1 倍及以上和28 個(gè)離子 （9 個(gè)ESI＋離子和19 個(gè)ESI－離子）峰強(qiáng)度降低50%及以上，葉部出現(xiàn)31 個(gè)離子（19 個(gè)ESI＋離子和12 個(gè)ESI－離子）峰強(qiáng)度增加1 倍及以上和41 個(gè)離子（15 個(gè)ESI＋離子和26 個(gè)ESI－離子） 峰強(qiáng)度降低50%及以上。

2.5 與大麗輪枝菌侵染相關(guān)的重要棉花代謝產(chǎn)物鑒定

本檢測(cè)中，鎖定相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)誤差為2.1×10－5，因此推定誤差介于－2.0×10－5～2.0×10－5的匹配物質(zhì)作為供試次生代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果。 據(jù)以上576 個(gè)重要差異代謝產(chǎn)物m/z 計(jì)算出對(duì)應(yīng)的所有可能準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)一步計(jì)算與自建棉花代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)的各物質(zhì)準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量的誤差。 結(jié)果表明9 個(gè)ESI＋離子和68 個(gè)ESI－離子匹配47 個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的棉花代謝產(chǎn)物， 分別占相應(yīng)供鑒定離子數(shù)量的11.0%和13.8%，86.6%的離子沒能得到鑒定。

2.5.1 正離子鑒定。 9 個(gè)被鑒定的ESI＋離子（離子 編 號(hào)205、545、721、794、916、1032、1223、1653和2966）對(duì)應(yīng)11 個(gè)物質(zhì)，被推定15 次，均屬于萜類物質(zhì)（表1）。 其中，6 個(gè)離子匹配唯一報(bào)道過的棉花代謝產(chǎn)物，5 個(gè)為杜松烷倍半萜 （半棉酚2個(gè)、6- 甲氧基棉酚2 個(gè)和6,6'- 二甲氧基棉酚1個(gè)），1 個(gè)為二萜類（赤霉素A4）；2 個(gè)離子各匹配2 個(gè)棉花代謝產(chǎn)物， 均為杜松烷倍半萜棉素和6-甲氧基半棉酚；1 個(gè)離子匹配5 個(gè)棉花代謝產(chǎn)物，為杜松烷倍半萜1 (10),4-cadinadien-2-ol、12- 羥基-β-石竹烯、氧化紅沒藥烯、桉油烯醇和氧化石竹烯。

病原菌處理與對(duì)照相比，離子545（鑒定為赤霉素A4）峰強(qiáng)度僅在莖部減少72%，離子1032[1(10),4-cadinadien-2-ol、12- 羥基-β- 石竹烯、氧化紅沒藥烯、桉油烯醇和氧化石竹烯]僅在葉部增加7.6 倍， 其他7 個(gè)離子均在根部增加3.2 倍以上，變化最大的為離子916（6-甲氧基棉酚），增加了105 倍。

2.5.2 負(fù)離子鑒定。 68 個(gè)被鑒定的ESI－離子對(duì)應(yīng)了41 個(gè)物質(zhì)，被推定89 次，其中53 個(gè)離子匹配唯一報(bào)道過的棉花代謝產(chǎn)物，13 個(gè)離子匹配2個(gè)棉花代謝產(chǎn)物，1 個(gè)離子匹配4 個(gè)棉花代謝產(chǎn)物，1 個(gè)離子匹配6 個(gè)棉花代謝產(chǎn)物（表2）。這41個(gè)物質(zhì)分別屬于杜松烷倍半萜 （出現(xiàn)頻次51次）、黃酮（18 次）、碳水化合物（9 次）、二 萜（4次）、雜倍半萜（4 次）、脂肪族（1 次）、環(huán)法尼烷倍半萜（1 次）和酚類（1 次）；出現(xiàn)頻次最多的物質(zhì)為棉酚（17 次），其次為棉籽糖（6 次），兒茶酚、1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 9-glucoside、赤霉素A13和1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 10-glucoside各出現(xiàn)4 次，6,6'- 二甲氧基棉酚、6- 甲氧基半棉酚、6- 甲氧基棉酚、6- 脫氧半棉酚和棉素各出現(xiàn)3 次，白矢車菊素、青榆烯D、紫云英苷、異紫云英苷和半棉酚酮各出現(xiàn)2 次， 其他25 個(gè)物質(zhì)分別僅出現(xiàn)1 次（圖7）。

圖6 病原菌處理較健康對(duì)照峰強(qiáng)度增加1 倍及以上或降低50%及以上的差異離子在棉花組織中分布情況Fig. 6 Distribution of distinguished differential ions of peak intensity increased by ≥1 fold or decreased by ≥50%in pathogen-treated cotton tissues compared to corresponding healthy controls

病原菌處理與健康對(duì)照相比，離子43（鑒定為6- 脫氧半棉酚） 峰強(qiáng)度在莖部增加1.2 倍，葉部減少79%；離子499（半棉酚酮）僅在根部減少57%，其他66 個(gè)離子均在根部表現(xiàn)增加，其中30個(gè)離子推定的物質(zhì)的峰強(qiáng)度均增加10 倍以上[脫落酸（離子編號(hào)1476）、1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 10-glucoside 和1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 9-glucoside（2274）、6-脫氧半棉酚（1056）、6- 甲氧基棉酚 （1090、1679、2724）、6,6'- 二甲氧基棉酚（560、3454）、紫云英苷和異紫云英苷（1036）、兒茶 酚（1104、2712）、棉 籽 菁（1325）、棉 酚（823、1060、1061、1202、1203、1789、2217）、 棉 紫 色 素（2617）、半棉酚（494）、青榆烯A（175）、青榆烯C（40）、青榆烯D（506）、白矢車菊素（469、1719）、棉籽糖（543、1555、1556、1799）]。

圖7 負(fù)離子模式下超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜推測(cè)鑒定的重要差異代謝物種類及檢出頻次Fig. 7 Types and detection frequency of distinguished differential metabolites putatively identified by UPLC-ESIMS under negative ionization mode

表1 正離子模式下超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜推測(cè)鑒定的棉花組織提取物中重要差異代謝物Table 1 Distinguished differential metabolites in cotton tissue extracts putatively identified by UPLC-ESI-MS under positive ionization mode

表2 負(fù)離子模式下超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜推測(cè)鑒定的棉花組織提取物中重要差異代謝物Table 2 Distinguished differential metabolites in cotton tissue extracts putatively identified by UPLC-ESI-TOF/MS under negative ionization mode

表2 （續(xù)）Table 2 (Continued)

表2 （續(xù)）Table 2 (Continued)

表2 （續(xù)）Table 2 (Continued)

3 討論

3.1 棉花代謝組分析時(shí)質(zhì)譜檢測(cè)模式選擇

本研究在棉花代謝組分析中，采用正離子模式（ESI＋）和負(fù)離子模式（ESI－）對(duì)所有供試樣本中代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)， 分別獲得了4 572 個(gè)ESI＋離子和3 960 個(gè)ESI－離子。 經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)分析， 篩選到VIP＞1 和處理間峰強(qiáng)度差異顯著（p＜0.05）的ESI－離子858 個(gè)，為ESI＋離子（131個(gè)）的6.5 倍，在根、莖、葉組織中2 種模式下差異離子比例分別為7.5、7.9 和7.1。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，病原菌處理較對(duì)照離子峰強(qiáng)度增加1 倍及以上或降低50%及以上的差異離子中，ESI－離子數(shù)量為494 個(gè)，為ESI＋離子總數(shù)（82 個(gè)）的6.0 倍，在根、莖、葉組織中2 種模式下差異離子比例分別為13.0、2.9 和1.1。 以上結(jié)果表明，采用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，2 種檢測(cè)模式檢測(cè)到的棉花代謝產(chǎn)物離子數(shù)量相差不大，但在進(jìn)一步挖掘處理間差異代謝產(chǎn)物時(shí)，ESI－離子的數(shù)量明顯大于ESI＋離子，并且在棉花根、 莖、 葉組織中也表現(xiàn)同樣的規(guī)律。Moco 等[34]在利用液相色譜- 質(zhì)譜分析番茄代謝組時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同離子模式檢測(cè)下番茄代謝產(chǎn)物的離子信號(hào)強(qiáng)度存在明顯差異。 因此，建議在采用UPLC-ESI-MS 進(jìn)行棉花代謝組學(xué)分析時(shí)，選擇負(fù)離子模式檢測(cè)方法。

3.2 不同處理間棉花差異代謝產(chǎn)物分布

基于VIP＞1 和處理間離子峰強(qiáng)度t 檢驗(yàn)p＜0.05 挖掘出大麗輪枝菌接種處理與健康對(duì)照間的差異代謝產(chǎn)物，在根、莖、葉組織中分別分布500 個(gè)離子（59 個(gè)ESI＋離子和441 個(gè)ESI－離子）、364 個(gè)離子（41 個(gè)ESI＋離子和323 個(gè)ESI－）、390 個(gè)離子（48 個(gè)ESI＋離子和342 個(gè)ESI－離子），比例為1.37∶1∶1.07。 這一結(jié)果表明，差異代謝產(chǎn)物在根部分布比例較高，在葉部和莖部分布比例較低且差異不大；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，病原菌處理較對(duì)照離子峰強(qiáng)度增加1 倍及以上或降低50%及以上的重要差異代謝產(chǎn)物，在根、莖、葉各組織中，分別分布461 個(gè)離子（33 個(gè)ESI＋離子和428 個(gè)ESI－離子）、77 個(gè)離子（20 個(gè)ESI＋離子和57 個(gè)ESI－離子）、72 個(gè)離子 （34 個(gè)ESI＋離子和38 個(gè)ESI－離子），比例為5.98∶1∶0.94。 這一結(jié)果表明，病原菌處理與健康對(duì)照間重要差異代謝產(chǎn)物在根部分布數(shù)量也最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉部和莖部。 綜上所述，在棉花苗期大麗輪枝菌接種8 d時(shí)，病原菌處理和健康對(duì)照間重要差異代謝產(chǎn)物的分布具有一定的組織偏好性， 主要存在于棉花根部。 對(duì)造成此種現(xiàn)象的原因，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3.3 代謝產(chǎn)物鑒定

LC-MS 分析技術(shù)是代謝組分析的最高效和最靈敏的方法，但LC-MS 系統(tǒng)的多樣性以及LC較低的保留時(shí)間再現(xiàn)性，嚴(yán)重限制了單一優(yōu)化分析方法的建立， 妨礙實(shí)驗(yàn)室間LC-MS 色譜圖的比較。 同時(shí)，缺少將LC-MS 質(zhì)譜數(shù)據(jù)自動(dòng)轉(zhuǎn)換為（推定的）植物代謝物的高效軟件工具。 這意味著對(duì)大量信號(hào)數(shù)據(jù)集的分析只能在現(xiàn)有的化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（如SciFinder、Pub-Chem、Massbank 或Dictionary of Natural Products）中進(jìn)行手動(dòng)搜索[34]，而這些數(shù)據(jù)庫(kù)的信息來自一般的化學(xué)物質(zhì)，在化合物來源上缺乏與植物關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致植物代謝組鑒定時(shí)推定的物質(zhì)種類存在多種可能性，同時(shí)因?yàn)槭謩?dòng)搜索，篩選效率也受到極大限制。 因此，如何實(shí)現(xiàn)代謝產(chǎn)物的準(zhǔn)確鑒定成為代謝組分析中的重要難題。 在線XCMS 軟件的出現(xiàn)，在一定程度上解決了不同型號(hào)LC-MS 系統(tǒng)采集的數(shù)據(jù)處理，實(shí)現(xiàn)特征離子檢測(cè)、保留時(shí)間校正、對(duì)齊、注釋、統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)可視化處理的自動(dòng)化，為完整的非目標(biāo)元組工作流程提供了解決方案[35]。同時(shí)，該技術(shù)能自動(dòng)搜索和匹配METLIN 串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)代謝產(chǎn)物高通量和高效鑒定[36]。 本研究結(jié)果表明， 通過在線XCMS 軟件進(jìn)行了代謝產(chǎn)物鑒定，發(fā)現(xiàn)匹配物質(zhì)與報(bào)道的棉花代謝產(chǎn)物存在較大差異，所以該軟件在針對(duì)具體植物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定時(shí)存在較大的局限性。 為保證鑒定的代謝產(chǎn)物均為棉花代謝產(chǎn)物，本研究建立了棉花代謝數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)LC-ESI-MS 分析中ESI＋和ESI－模式下加合物存在的一般規(guī)律， 利用MATLAB 軟件計(jì)算程序計(jì)算出檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物離子m/z對(duì)應(yīng)的所有可能準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)一步計(jì)算與代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)中各物質(zhì)準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量間的誤差，根據(jù)鎖定的相對(duì)分子質(zhì)量（甲酸鈉）檢測(cè)誤差設(shè)定誤差閾值，以小于此閾值推定的匹配物質(zhì)作為供試代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果，保證了供鑒定的物質(zhì)匹配的僅是棉花代謝產(chǎn)物，在一定程度上解決了物質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性。 但鑒定結(jié)果表明仍有86.6%的離子未能得到鑒定。 這可能與本研究建立的棉花代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)庫(kù)容量小有關(guān)。 所以，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)研究和建設(shè)棉花次生代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)。

3.4 病程相關(guān)的代謝產(chǎn)物

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在大麗輪枝菌與棉花早期互作（接種后1～4 d）中，脫氧半棉酚、半棉酚、棉酚、半棉酚酮、殺實(shí)夜蛾素（H1、H2、H3和H4）及其甲氧基和二甲氧基衍生物等倍半萜類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)可在抗病棉花植株中大量出現(xiàn)[31,37]，而且倍半萜類物質(zhì)合成途徑的分子調(diào)控研究是棉花分子抗病育種工作的重點(diǎn)之一[38]。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)本方法鑒定，大麗輪枝菌處理與健康對(duì)照棉株間77 個(gè)重要差異次生代謝產(chǎn)物離子（9 個(gè)ESI＋離子和68 個(gè)ESI－離子）推定到匹配物質(zhì)48 個(gè)，在供鑒定離子（576 個(gè)）中占比僅為13.4%。 被鑒定的ESI＋離子對(duì)應(yīng)11 個(gè)物質(zhì)，被推定15 次，均屬于倍半萜類物質(zhì)；被鑒定的ESI－離子對(duì)應(yīng)41 個(gè)物質(zhì)， 被推定物質(zhì)89 次，其中倍半萜類56 次（杜松烷倍半萜51 次、雜倍半萜4 次、環(huán)法尼烷倍半萜1 次）、二萜類4 次，黃酮類18 次、碳水化合物9 次、脂肪族1 次和酚類1 次。 該結(jié)果表明在大麗輪枝菌與棉花互作過程中，這些物質(zhì)在棉花體內(nèi)的積累量發(fā)生了顯著變化，與健康對(duì)照相比，除二萜類物質(zhì)赤霉素A4（在莖部減少72%）外，其余在棉花體內(nèi)積累量均增加1 倍以上。 這與文獻(xiàn)報(bào)道[31,37]一致。

本研究鑒定出的酚類物質(zhì)（咖啡酸）、黃酮類物質(zhì)（紫云英苷、異紫云英苷、五椏果素、兒茶素、棉花素-8- 鼠李糖苷、棉籽菁、草質(zhì)素-7- 葡萄糖苷、白矢車菊素、槲皮素-3’- 葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-7- 葡萄糖苷和α,2',3,3',4,4',6-庚羥基查耳酮2'- 葡萄糖苷），在大麗輪枝菌與棉花互作相關(guān)文獻(xiàn)中未見報(bào)道；鑒定出的碳水化合物（蜜二糖、蔗糖、蔗糖-6- 磷酸酯）和脂肪族物質(zhì)（1- 三十四烷醇），在病原菌- 植物互作有關(guān)的文獻(xiàn)中也未見報(bào)道。 另外，本研究中獲得的大麗輪枝菌與棉花互作重要差異次生代謝產(chǎn)物中86.6%的離子未獲得鑒定，這些物質(zhì)中可能有大麗輪枝菌與棉花互作過程中新的病程相關(guān)代謝產(chǎn)物。 這些物質(zhì)是否影響及通過何種方式影響棉花對(duì)黃萎病的抗病性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究。

4 結(jié)論

UPLC-ESI-MS 負(fù)離子檢測(cè)模式比較適合棉花代謝組分析。 這些重要次生代謝產(chǎn)物的差異是大麗輪枝菌與棉花互作的結(jié)果，與棉花黃萎病的病程相關(guān)。 除半萜類外，新發(fā)現(xiàn)的黃酮類、酚類、碳水化合物、脂肪族以及未獲得鑒定的物質(zhì)可能在棉花黃萎病病程中發(fā)揮重要作用，為深入解析棉花黃萎病機(jī)制提供了重要線索。