朱藝丹

摘 要：骨組織是由有機和無機成分組成的復合材料。在外科手術中常常需要涉及到骨骼的固定和修復，傳統(tǒng)的植入鋼釘固定連接方法不僅與組織不相容，增加感染風險而且需要二次去除，給患者增加額外痛苦，而采用生物友好型的骨粘合劑則有效的避免了上述弊端，且骨粘合劑在對骨組織進行粘接后，隨著骨組織的愈合，降解為無毒產物。文章旨在概述骨粘合劑的發(fā)展、現(xiàn)狀和當今的知識的基礎上。指出明膠基復合材料具有良好的生物相容性，可降解性，能夠很好的運用于骨組織修復和骨粘合劑中。在基礎研究人員和外科醫(yī)生的共同努力下，這一課題取得了巨大的進展。結果表明，人工合成生物材料的應用將在未來的骨科手術中取得成功。

關鍵詞：骨粘合劑; 明膠; 降解性; 生物相容性

中圖分類號：TQ431.3;R318.08 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-5922（2020）10-0005-05

Abstract：Bone tissue is a composite material composed of organic and inorganic components. In surgical operations， the fixation and repair of bone are often involved. The traditional fixation and connection method of implanted steel nail is not only incompatible with the tissue， increasing the risk of infection， but also needs to be removed twice， which causes extra pain to the patients. However， the use of bio-friendly bone adhesive can effectively avoid the above disadvantages， and after the bone adhesive is bonded to the bone tissue， it degrades into a non-toxic product as the bone tissue heals. The following paper aims to summarize the development， current situation and current knowledge of bone adhesives. It is pointed out that gelatin-based composite materials have good biocompatibility and degradability， and can be used in bone tissue repair and bone adhesive. With the joint efforts of basic researchers and surgeons， great progress has been made in this subject. The results show that the application of synthetic biomaterials will be successful in the orthopedic surgery.

Key words：bone adhesive; gelatin; degradability; biocompatibility

0? ? ?引言

開發(fā)骨粘合系統(tǒng)的第一次嘗試來自埃及，已有4000多年的歷史。幾個世紀后的1772年，巴黎石膏被引進，至今仍被用于骨折固定。其他的如環(huán)氧樹脂，氰基丙烯酸酯，聚氨酯和纖維粘合劑。但這些探索多以失敗告終，因為它們不符合醫(yī)學要求，如生物相容性、儲存期間的穩(wěn)定性、對人體無毒性、可消毒、易于使用、可吸收和降解、能在潮濕環(huán)境中固化。

盡管這一領域的研究由來已久，目前尚未找到一種有效運用于臨床上適用的替代方法。而明膠基復合材料，能夠快速地粘合組織，即使在有水分的情況下，作為一種外科粘合劑和止血劑取得了良好的應用效果，具有良好的生物相容性，粘接能力以及可降解能力，被認為是最有可能運用于骨粘合劑的實際應用中。文章概述了骨粘合劑的要求、發(fā)展歷史、現(xiàn)狀和研究成果總結，指出明膠基復合材料具有良好的生物相容性，可降解性，能夠很好的運用于骨組織修復和骨粘合劑中。

1? ? ?醫(yī)用骨粘合劑發(fā)展歷史

一個多世紀前，柏林的Gluck提出了利用生物材料進行骨結合的想法，當時他將軟組織與雞血衍生物結合，將骨組織與“l(fā)itocolle”結合。他報告了用樹脂、浮石和巴黎石膏制成的骨膠。第一種骨粘合劑是在1931年由Hedri描述的。他把膠原蛋白和纖維蛋白的混合物稱為“骨細胞”。這種“骨細胞”促進骨折愈合并展現(xiàn)了良好的初始結合強度，但嚴重的過敏反應阻止了其使用。

1.1? ?環(huán)氧樹脂

在1958年報告了一例用環(huán)氧樹脂在人體內固定植入物的病例，據(jù)了解，這種植入物已經(jīng)放置了10多年。然而，由于這些材料，特別是硬化劑的毒理學性質可疑，已發(fā)表的研究很少。在另一個用環(huán)氧樹脂材料粘合植入物的實例中，這種材料能夠承受一定的外力，從而在不銹鋼假體中產生彎曲，而不會導致粘接斷裂。在矯正假體的手術中，髓質沒有反應。在隨后的死后檢查中，假體附近的組織含有雙折射材料、纖維組織、一些滑膜襯里和許多巨細胞。在這種情況下，使用了帶有聚酰胺硬化劑的傳統(tǒng)樹脂，因為人們認為這克服了對這些材料可能毒性的反對意見。進一步研究表明，環(huán)氧樹脂材料存在難以吸收以及不利于愈合的缺陷。環(huán)氧樹脂會在粘合劑周圍引發(fā)纖維囊，起到阻礙骨痂形成的作用，不會因水分、脂質或血液而粘附在骨骼上，并因聚合熱而導致組織壞死。

1.2? ?聚氨酯泡沫

1959年，一種叫做“Ostamer”的聚氨酯泡沫被開發(fā)出來。最初，它被認為是可生物降解的，并且具有適當?shù)目讖揭栽试S骨生長，提供良好的初始粘附性，并且被組織很好地耐受。在相關的研究報道中，詳細介紹了6例3年～ 4個月的成功病例，其中采用硬質聚氨酯泡沫塑料填隙，夾板固定骨折骨。該材料是由異氰酸酯和多元醇組分混合加熱而成。不幸的是，其他在動物和人類病例中使用這種材料的經(jīng)驗非常不令人滿意。聚合溫度高達70℃，附著力弱，吸收慢。許多研究觀察到假關節(jié)炎、感染、組織壞死和瘢痕形成延遲。雖然在某些情況下獲得了成功的結果，但高百分比的失敗表明，材料本身可能存在變異性，隨之產生的毒性以及操作的臨界性。這導致了強烈的反作用。

1.3? ?氰基丙烯酸酯

氰基丙烯酸酯膠粘劑是由開發(fā)于1959年。它們巨大的結合強度和在潮濕環(huán)境中的結合能力立即引起了醫(yī)學界的關注。通過改變所附烷基鏈的長度，可以合成各種有用的2-氰基丙烯酸酯。一般來說，在空氣中用較短的烷基鏈氰基丙烯酸酯進行聚合更快，但由于表面的良好潤濕性，聚合速率和組織中的結合強度隨著烷基鏈長度的增加而增加。

1.4? ?聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）

自20世紀30年代以來，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）已廣泛應用于牙科和骨科手術中，用于修復體的密封。這不是真正的粘連，但與松質骨緊密相連。研究表明，只要骨折表面沒有被完全封閉，人類骨折就可以在PMMA周圍愈合。這促使PMMA在各種骨折情況下的應用，其中PMMA被用作常規(guī)固定的空間填充物或加固物。PMMA也被認為是一種主要的內固定方法。使用液體丙烯酸樹脂、磷酸蝕刻或三丁基硼烷也提高了PMMA與骨的粘合質量。大多數(shù)研究顯示這種材料可以使骨折具有良好的固定強度和充分的愈合。雖然在下頜骨骨折、脊柱骨折和孤立性長骨骨折中有良好的結果，但晚期移位和不愈合阻止了它們推薦作為骨粘合劑的使用。

1.5? ?纖維蛋白粘合劑

纖維蛋白粘合劑的使用始于1940年。目前它們是最流行的軟組織粘合劑。大多數(shù)纖維蛋白粘合劑系統(tǒng)由含有纖維蛋白原、凝血酶、鈣和因子XIII的混合物組成。因子XIII被認為是體內成功粘附的必要穩(wěn)定劑。同源纖維蛋白原治療效果較好。

博世公司對纖維蛋白凝塊作為粘合劑的體外特性進行了廣泛的研究。其研究的纖維蛋白粘合劑（通常縮寫為FKS，來自德國的“纖維蛋白klebesystem”）在歐洲已被廣泛用于普通外科、眼科、耳鼻咽喉、泌尿外科和神經(jīng)外科等等。除了用作粘合劑外，纖維蛋白粘合劑還被證明有助于止血和加速愈合，可通過增加骨移植、皮質骨愈合、肌腱修復和截骨術中的血運重建率。一些研究表明纖維蛋白粘合劑在組織中具有良好的耐受性。

1.6? ?明膠間苯二酚醛

這種材料的基礎是明膠的性質與結締組織相似，并且本身具有粘性。明膠與甲醛和間苯二酚交聯(lián)以提高耐水性和強度，制備出一種粘合劑，該粘合劑通過與甲醛交聯(lián)而與濕組織結合。動物研究結果表明，GRF組分既可用作組織粘合劑，也可用作止血劑。組織刺激性低于氰基丙烯酸酯，盡管這仍然帶來一些問題，特別是在血管閉合方面。這種材料在體外的結合強度優(yōu)于甲基氰基丙烯酸酯。具有優(yōu)異的拉伸強度和組織相容性。但是，使用這種材料在家兔的脾-肝接合手術實驗中發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)縫合方法中脾-肝之間很快建立了血管連接相比，在使用這種材料作為粘合劑時，家兔沒有獲得脾-肝血管連接，這容易導致器官因缺血而壞死。說明這種粘合劑在實際應用上仍存在一定的問題。

1.7? ?低聚聚內酯膠粘劑

脂肪族羥基羧酸衍生的生物可降解聚酯已被開發(fā)用于外科縫線、藥物遞送裝置、組織支架和骨內固定植入物等醫(yī)療應用。這些材料大多是由高分子量線性聚酯，如聚乳酸、聚乙醇及其共聚物制成。低聚物酯的研究較少，因為這些低聚物通常不具備縫合或植入所需的機械和熱性能。

2? ? ?試驗方法

在葡聚糖主鏈上化學修飾引入2-異氰酸酯-甲基丙烯酸乙酯（IEMA）光交聯(lián)乙烯基，高碘酸鈉與鄰二醇和明膠氧化反應引入醛基，不僅可以形成分子間網(wǎng)絡，還可以形成分子間網(wǎng)絡通過醛基增加組織交聯(lián)。同時測定體系的物理性能（粘接強度、溶脹率）。觀察水凝膠對細胞的粘附和增殖作用。表明該材料能夠有效應用于骨粘合劑中。

2.1? ?材料

右旋糖酐（Mw 20 kDa）購自國藥化學試劑有限公司（中國上海）。2-異氰酸酯甲基丙烯酸乙酯（IEMA）購自中國上海金瑞化學試劑有限公司。以二月桂酸二丁酯（DBTL）為催化劑，從阿拉丁試劑公司（中國上海）采購，光引發(fā)劑2-羥基-1-[4-（羥基乙氧基）苯基-2-甲基-1-丙酮，二甲基亞砜等試劑均來自北京化學試劑有限公司（中國北京）。

2.2? ?光交聯(lián)明膠復合材料的制備

采用前驅體溶液光交聯(lián)法制備水凝膠。分別以5%的明膠和一系列濃度為15%、25%、35%、45%的Dex-U-AD濃度在PBS中制備遞推溶液，制備出Dex-U-AD/明膠水凝膠。具體步驟如下：在40℃水浴下將溶液劇烈攪拌10min，然后添加1%的光引發(fā)劑Irgacure 2959（I-2959）。光引發(fā)劑的最終濃度保持在1wt%。均勻化后，將溶液注入模具。該系統(tǒng)在紫外光源（320～480nm）下照射，導光板與樣品之間的距離固定在44mm，光強調整為5、10、15、30和50mW/cm～2。

2.3 粘合強度的測量

將20%明膠溶液均勻地涂在玻璃片表面，模擬活體組織。一塊玻璃的尺寸為5mm×20mm×50mm。在70℃干燥20min后，玻璃表面有一層均勻的明膠。然后，將玻璃片疊放在10mm內，將Dex-U-AD溶液分散在其中，粘合面積為20mm×10mm。用30mw/cm～2的紫外光照射10min，使DexU在明膠片之間交聯(lián)。采用美國Instron公司的1185型萬能試驗機，在室溫下以5mm/min的十字頭速度對紫外光固化后的玻璃樣品進行測試。每個實驗測量5個樣品。

2.4? ?溶脹動力學的測定

干凝膠（重量W0）在37℃下浸入PBS中，并在一定時間間隔內持續(xù)振蕩。去除多余的表層水后，測量膨脹水凝膠（Ws）的重量，直到不再檢測到重量變化為止。

2.5? ?細胞毒性分析

采用ISO10993-5標準試驗方法，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠成纖維細胞（L929），加入10%胎牛血清、1.0%青霉素鏈霉素和1.2%谷氨酰胺。培養(yǎng)物主要保存在37℃、含5%二氧化碳的潮濕大氣中。當細胞達到80%匯合時，用含1×103m乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶進行胰蛋白酶化。

用MTT法（3 - [ 4-二甲基噻唑-2-基] - 2，5 -二苯基四唑溴;噻唑藍）測定細胞活性。MTT法：用高壓蒸汽對厚度為0.2 mm（不含醋酸）的薄膜進行消毒15min，置于24孔培養(yǎng)板上。然后將樣品在37℃的1mL DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。提取率為100 mg/mL。在此期間結束時，去除薄膜，獲得所謂的提取物。L929細胞接種于96孔板上，每孔103個細胞。培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)基，用已制備好的提取液代替，再培養(yǎng)24h，然后向每個孔中加入100μLMTT溶液。在37℃孵育4h后，加入200μL二甲基亞砜以溶解福爾馬贊晶體。用振動篩均勻旋轉溶解溶液約10min。用ELISA閱讀器（芬蘭Labsystem公司的Multiscan MK3）在570nm處檢測福爾馬贊溶液的光密度。

3 結果和討論

3.1 粘結強度分析

圖1（a）表明，隨著DO的增加，凝膠的粘合強度顯著提高。醛基不僅增加了Dex- U-AD與明膠的交聯(lián)密度，而且提高了膠粘劑的粘接力，隨著醛含量的增加，凝膠的粘結強度最終達到飽和。用30 wt%（25%Dex-U-AD+5%明膠）Dex-U-AD/明膠的溶解氧（DO）為41.6%表征了這種飽和狀態(tài)，得到的最高斷裂強度為4.16mpa，是Dex-U體系相同含量時的2倍。圖1（b）～（d）表明5%的明膠有助于提高粘合強度。特別是當凝膠的固含量達到30%（25%Dex-U-AD）時，Dex-U-4（DO：22.82%）/明膠（4.16±0.72mpa）和Dex-U-8-AD（DO：10.95%）/明膠凝膠（3.46±0.032mpa）比Tisseel（0.05mpa）高83倍。

3.2? ?溶脹動力學

未添加明膠的Dex-U-AD水凝膠由于膨脹率高和機械強度差而破碎成不同大小的碎片。它不能以不規(guī)則的形狀精確稱重。圖2顯示了Dex-U-AD/明膠水凝膠在pH7.4的PBS中的溶脹動力學。隨著醛含量的增加，Dex-U-AD/明膠水凝膠的最大溶脹率降低。當固定總固形物含量為25 wt%的Dex-U-4-AD（DO：22.82%）和5 wt%的明膠時，在100 min時，Dex-U-4-AD（DO：22.82%）凝膠的固形物含量從227±11%顯著降低到103±0.77%。

溶脹率對交聯(lián)密度、凝膠組成和電荷密度有較大影響。溶脹率的下降歸因于與其他互穿明膠的席夫反應。因此，醛基含量越高，交聯(lián)密度越高，說明平衡溶脹率越低。

3.3? ?細胞毒性分析

毒性試驗是生物材料的一個重要方面。理想的生物粘附劑不應釋放毒性產物或產生對抗性作用，可通過體外細胞毒性試驗進行評價，是生物材料的一項基本性能。圖3所示為小鼠成纖維細胞（L929）的MTT法測定所得的吸光度，該細胞是用不同類型標本的提取液培養(yǎng)的。L929細胞活性在72h內，除Dex-U-AD/明膠（40 wt%）外，大多數(shù)水凝膠提取物與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p<0.05），72h內細胞活力與對照組相比無統(tǒng)計學差異（p>0.05），但細胞活力仍達到陰性細胞的85%左右控制。這表明Dex-U-AD/明膠對L929細胞的毒性較小。

4 結語

盡管在過去的10年里在組織和骨粘合劑方面做了大量的工作，但是很明顯，成功的骨粘合劑的發(fā)展還處于早期階段。環(huán)氧樹脂、氰基丙烯酸酯、聚氨酯等材料的研究，由于強度不夠和生物相容性差，一直沒有得到證實。然而，這一概念似乎是切實可行的，開發(fā)一種具有快速有效作用、相對無毒的材料應該是可能的。此外，這種粘合劑還可以作為藥物的培養(yǎng)基，類似于今天使用的抗生素骨水泥。

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