王若崢, 范佩文

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心， 烏魯木齊 830011； 2新疆腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011；13中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤免疫與放療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011)

近年來，免疫療法作為腫瘤治療的一大突破受到越來越多的關(guān)注。腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一是T細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)受體(immune checkpoint receptor, ICR)表達(dá)的重編程[1]。ICRs是一類共刺激因子(CD27、CD28和CD137)和共抑制受體(如PD-1、CTLA-4、LAG-3等)，它們共同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的反應(yīng)質(zhì)量。目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢查點(diǎn)阻斷(immune checkpoint blockade, ICB)治療策略是靶向PD-1/PD-L1和CTLA-4信號通路，以調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫活性，并顯示出一定的臨床療效[2]。

ICB對多種免疫原性強(qiáng)的惡性腫瘤有效。美國食品藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)已批準(zhǔn)將ICB藥物用于黑色素瘤，NSCLC，腎細(xì)胞癌，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，霍奇金淋巴瘤，尿路上皮癌，胃癌，宮頸癌等的臨床治療[3]。雖然相當(dāng)一部分患者表現(xiàn)出客觀的臨床反應(yīng)，但由于原發(fā)性或獲得性耐藥，大多數(shù)患者對ICB治療反應(yīng)不佳。迄今為止，治療效果最差的是抗CTLA-4，約85%的患者無反應(yīng)[4]，其次是抗PD-1，反應(yīng)約40%[5]。聯(lián)合治療方案的反應(yīng)率較高(約50%)，但毒性也較高[6]。因此，迫切需要預(yù)測ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

1 誘導(dǎo)抑制性免疫檢查點(diǎn)(ICs)是腫瘤免疫逃逸的主要機(jī)制

免疫編輯假說概念化了腫瘤細(xì)胞在免疫壓力下向腫瘤擴(kuò)散和免疫監(jiān)視逃逸的進(jìn)化過程。有幾個因素促成了這種免疫逃避。腫瘤微環(huán)境(TME)本身具有免疫抑制作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞因子、趨化因子和抑制因子的進(jìn)展[7]。例如，VEGFA可以上調(diào)CD8 + T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，而TGF-β增強(qiáng)PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)[8-9]。此外，TME還可以招募免疫抑制免疫細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等來逃避免疫清除。在免疫攻擊的壓力下，腫瘤細(xì)胞可通過減少基因表達(dá)或丟失突變等位基因來減少T細(xì)胞識別的新抗原的數(shù)量[10]。

在腫瘤發(fā)生和生長過程中發(fā)生的免疫抑制的主要機(jī)制之一是多種共抑制性受體(ICR)的上調(diào)，這些受體在腫瘤-基質(zhì)界面以及基質(zhì)本身內(nèi)部產(chǎn)生一系列相互作用，導(dǎo)致阻斷免疫攻擊和T細(xì)胞耗竭。T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵標(biāo)志是ICR的表達(dá)，導(dǎo)致效應(yīng)功能喪失和無法轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃汿細(xì)胞池。T細(xì)胞耗竭在各種腫瘤中的重要性與慢性感染期間發(fā)生的耗竭相似。慢性抗原刺激可觸發(fā)多種高水平抑制受體的共表達(dá)，包括PD-1、CTLA-4和T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白域-3 (TIM-3)等[11]。其中PD-1/PD-L1信號軸在免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)控中起主導(dǎo)作用，而CTLA-4與PD-1一樣通過阻斷T細(xì)胞激活的共刺激來建立免疫抑制相互作用，維持外周免疫耐受。鑒于PD-1 / PD-L1和CTLA-4途徑在腫瘤免疫逃逸中的重要作用，抗PD-1 / PD-L1和抗CTLA-藥物及其組合已成為當(dāng)前主流的ICB腫瘤免疫療法。

2 臨床靶向ICR信號通路的機(jī)制

PD-1廣泛表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[12]。PD-1通常被認(rèn)為是顯性的抑制性ICR。與CTLA-4不同，PD-1信號通路的激活主要發(fā)生在適應(yīng)性免疫抑制級聯(lián)的效應(yīng)階段，阻斷了細(xì)胞毒性T細(xì)胞清除癌細(xì)胞的能力。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞中PD-1與腫瘤細(xì)胞中PD-L1之間的相互作用通過多種機(jī)制降低了T細(xì)胞的活性，包括抑制T細(xì)胞受體下游信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增強(qiáng)、B細(xì)胞的減少和自然殺傷細(xì)胞活性的降低[13-14]。PD-1與PD-L1的結(jié)合還阻斷了CD28和T細(xì)胞受體(TCR)信號的激活以及T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的接觸[15-16]。在與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞中，PD-1的高表達(dá)水平會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬的減少。其配體PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)導(dǎo)致Teff細(xì)胞溶解抗性，降低了顆粒酶A和穿孔蛋白的轉(zhuǎn)錄水平[17]。此外，PD-1信號通過穩(wěn)定免疫突觸形成，使CD4+和CD8+ T細(xì)胞在衰竭過程中喪失運(yùn)動能力[18]。PD-1信號在腫瘤免疫中的相關(guān)性可以通過CD8+ T細(xì)胞中的PD-1表達(dá)作為晚期黑色素瘤和宮頸癌患者腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞亞群的生物標(biāo)志物得到證實(shí)[19-20]。 另一個重要的ICR是CTLA-4，它通過與共刺激受體CD28競爭來削弱T細(xì)胞的活化，導(dǎo)致IL-2，IL-4，TNF-α和IFN-γ的水平降低，以及CD8+和CD4+T細(xì)胞的增殖減少。與PD-1的廣泛表達(dá)相反，CTLA-4主要在Treg細(xì)胞上表達(dá)并控制免疫自耐受和Treg誘導(dǎo)的免疫抑制[21]。CTLA-4通過排除DC與傳統(tǒng)T細(xì)胞(Tconv)的Treg物理附著，抑制DC上CD86/80的表達(dá)并削弱抗原啟動初始T細(xì)胞活化[22]。另外，在抗原暴露下，CTLA-4+CD4 +T細(xì)胞與DC的相互作用比CTLA-4-CD4+T細(xì)胞更短，從而導(dǎo)致IL-2水平和增殖降低[23]。此外，CTLA-4阻斷可拯救TH1類CD4效應(yīng)T細(xì)胞，并且可能與CD8 T細(xì)胞浸潤和細(xì)胞溶解活性的增強(qiáng)以及記憶性T細(xì)胞的形成有關(guān)[24]。

3 候選ICB反應(yīng)性生物標(biāo)志物

盡管對免疫檢查點(diǎn)的認(rèn)識和特異性免疫檢查點(diǎn)抑制劑的開發(fā)取得了重大進(jìn)展，但許多免疫原性腫瘤患者對ICB不敏感，同時嚴(yán)重的不良反應(yīng)和高昂的治療成本也使得對ICB應(yīng)答者的識別和生物標(biāo)志物的研究成為迫切需要。將治療前獲得的靜態(tài)生物標(biāo)志物與用于監(jiān)測和進(jìn)一步臨床分層的動態(tài)生物標(biāo)志物相結(jié)合，有望納入ICB治療方案。目前，ICB的應(yīng)答性生物標(biāo)志物候選已在不同的生物學(xué)水平(細(xì)胞、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄本、基因)、不同的部位(腫瘤、外周血)，以及與免疫和腫瘤相關(guān)細(xì)胞群上被發(fā)現(xiàn)[25]，生物學(xué)相關(guān)的臨床生物標(biāo)志物可能有助于預(yù)測ICB反應(yīng)。

3.1 遺傳和表觀遺傳標(biāo)志物在抗PD-1和抗CTLA-4單藥治療的背景下，多項(xiàng)研究探討了NSCLC和黑色素瘤中整體腫瘤突變負(fù)荷/新抗原負(fù)荷與ICB反應(yīng)之間的關(guān)系[26-28]。基因中的特定遺傳突變，例如JAK1 / 2和BRCA1/2，可以預(yù)測ICB的臨床療效，這可能是由于未能激活I(lǐng)FN-γ靶基因和DNA修復(fù)機(jī)制缺陷的腫瘤中突變負(fù)荷增加所致[29-31]。JAK家族成員的功能喪失突變使黑素瘤對IFN-γ刺激具有抵抗力，而對IFN-γ觸發(fā)的生長停滯不敏感[29]，并可能下調(diào)PD-L1表達(dá)，這是對PD-1封鎖脫敏的可能機(jī)制[30]。DNA雙鏈修復(fù)酶BRCA2中的突變導(dǎo)致突變負(fù)擔(dān)急劇增加，導(dǎo)致對PD-1阻斷的反應(yīng)性增強(qiáng)[26]。此外，在對CTLA-4和PD-L1阻斷有反應(yīng)的黑色素瘤患者中，IFN-γ誘導(dǎo)的IDO表達(dá)增加[32]。此外，在對PD-1阻滯的應(yīng)答者中觀察到通過TCR的β鏈測序鑒定出的更高的TCR克隆性[33]。

越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳標(biāo)記在致癌作用中的重要作用[34-35]。真核生物常見的DNA甲基化類型為5-胞嘧啶甲基化(5mC)。而5mC在TET家族酶氧化后產(chǎn)生5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC被稱為"第六種堿基"，可以調(diào)控基因表達(dá)，是一種重要的表觀遺傳修飾。研究表明5mC對于調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖并維持細(xì)胞毒性和輔助T細(xì)胞的分化至關(guān)重要，在抗原呈遞后5hmC沉積在關(guān)鍵免疫基因中對T淋巴細(xì)胞的活化和分化具有特定作用，而5hmC的變化比5mC的變化更動態(tài)[36]。例如肝癌細(xì)胞顯示出特定的甲基化和羥甲基化組譜，表明這些表觀遺傳標(biāo)記有可能用作診斷或預(yù)后生物標(biāo)記[37]。

3.2 轉(zhuǎn)錄生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄特征也可以提供對PD-1阻斷反應(yīng)的信息，尤其是當(dāng)DNA突變特征和免疫學(xué)特征相似時。ICB后與臨床結(jié)果相關(guān)的其他特征引入了新的假定的耐藥機(jī)制，例如層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的作用，這可能會形成屏障，使免疫細(xì)胞無法穿透腫瘤從而削弱免疫療法[38]。另外，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)RNA的表達(dá)與抗CTLA-4和PD-L1治療的臨床反應(yīng)相關(guān)[39]。

3.3 組織病理學(xué)生物標(biāo)志物在蛋白質(zhì)水平上，組織病理學(xué)生物標(biāo)志物包括PD-L1表達(dá)，PD-L1表達(dá)是黑色素瘤，NSCLC，腎細(xì)胞癌(RCC)和膀胱癌背景下抗PD-1和PD-L1單藥治療期間的生物標(biāo)志物候選物[40]。迄今為止，PD-L1是FDA批準(zhǔn)的唯一藥物ICB生物標(biāo)志物，用于pembrolizumab(抗PD-1)治療NSCLC，胃或胃食管交界處腺癌，宮頸癌和尿路上皮癌。

3.4 細(xì)胞生物標(biāo)志物腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞全景圖區(qū)分了CTLA-4和PD-1阻斷的臨床反應(yīng)和耐藥性。一方面，在腫瘤浸潤的CD8+ T細(xì)胞中，PD-1+CTLA4+T細(xì)胞中CD8+ T細(xì)胞的特定群體的存在與無進(jìn)展生存(PFS)相關(guān)。這些細(xì)胞代表腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞具有部分耗竭表型，它們更容易通過阻斷共抑制受體的相互作用而恢復(fù)活力。另一方面，單純挽救CD8+ T細(xì)胞不一定與臨床反應(yīng)相關(guān)。然而，當(dāng)涉及到腫瘤負(fù)荷時，循環(huán)中的復(fù)活的PD-1+Ki67+CD8+ T細(xì)胞比單獨(dú)的復(fù)活細(xì)胞計(jì)數(shù)更能預(yù)測PD-1阻斷后的PFS[41]。此外，CD8+ T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例與CTLA-4阻斷的黑色素瘤的腫瘤壞死呈線性相關(guān)[42]。

3.5 液體活檢生物標(biāo)志物循環(huán)成分在識別反應(yīng)性生物標(biāo)志物方面有很大的潛力，可以在體液中進(jìn)行非侵入性和動態(tài)的檢測。到目前為止，循環(huán)游離DNA (cfDNA)的檢測為多種腫瘤治療策略提供了臨床指導(dǎo)[43]。cfDNA中發(fā)現(xiàn)的突變是腫瘤活檢的可靠替代物，治療后cfDNA水平的升高可能與黑色素瘤患者的進(jìn)展性疾病有關(guān)。cfDNA水平在其臨床表現(xiàn)之前就能提供反應(yīng)信息，并能預(yù)測ICB治療的黑色素瘤患者的腫瘤負(fù)荷[44]。cfDNA中定量的拷貝數(shù)不穩(wěn)定性可以預(yù)測疾病的進(jìn)展，在免疫治療不同腫瘤的患者中，其總體準(zhǔn)確性優(yōu)于單獨(dú)的cfDNA濃度[45]。

最近的幾項(xiàng)研究也表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)的檢測和定量可以被認(rèn)為是ICB中一個有前途的候選循環(huán)生物標(biāo)志物。最近發(fā)表的一份病例報告將外周血中CTCs的檢測與轉(zhuǎn)移過程聯(lián)系起來，PD-L1在晚期頭頸癌患者的CTCs中高表達(dá)，提示PD-L1+ CTCs可以作為預(yù)測ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物[46]。屬于ICR途徑的蛋白也在液體活檢中被檢測到，并與反應(yīng)相關(guān)ICB治療前可溶性PD-L1水平較高的患者更容易進(jìn)展，治療后PD-L1水平的升高與ICB的部分應(yīng)答相關(guān)[47]。共抑制性T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白3 (TIM3)、PD-1、IL-15與CTLA-4阻斷后較長生存期呈負(fù)相關(guān)，其中IL-15增加了TIM3、PD-1的表達(dá)[48]。

4 展望

免疫檢查點(diǎn)封堵治療通過與共抑制性免疫受體競爭的抗體重新激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，是腫瘤免疫編輯和逃避免疫監(jiān)測的致命弱點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中也顯示出一定療效。然而，由于缺乏良好的反應(yīng)性生物標(biāo)志物和影響ICB療效的TME相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，很大一部分患者出現(xiàn)了先天性和獲得性耐藥，一些患者甚至出現(xiàn)了進(jìn)展性耐藥。正如我們在這篇綜述中所描述的那樣，許多研究都致力于尋找識別能夠預(yù)測ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物。因此，使用新的方法以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤內(nèi)在和外在的機(jī)制，并尋找可靠有效的ICB療效生物標(biāo)志物，為免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療療效的提高，毒性反應(yīng)的降低，從而為進(jìn)一步提供個性化腫瘤免疫治療策略具有重要意義。