高英，王情，郭紅，賀媛媛，張硯敏

1 寶雞市人民醫(yī)院，陜西寶雞721000；2 西京醫(yī)院；3 陜西省中醫(yī)醫(yī)院

妊娠期高血壓疾病(HDCP)是妊娠期常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率為5.2%～8.2%[1]。HDCP不僅可導(dǎo)致妊娠期血管功能障礙，還可引起早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒生長發(fā)育受限等，嚴(yán)重威脅母嬰安全。迄今為止，HDCP的發(fā)病機制仍不完全清楚，可能是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果[2]。腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是維持機體水電解質(zhì)平衡、血壓穩(wěn)定的內(nèi)分泌系統(tǒng)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)是RAS的關(guān)鍵酶，ACE基因第16內(nèi)含子插入/缺失(I/D)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。血管緊張素原(AGT)是RAS的重要組成部分，具有血壓調(diào)節(jié)作用，該基因第2外顯子M235T多態(tài)性可影響血液AGT水平，與高血壓發(fā)病密切相關(guān)[5]。為了明確外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性與HDCP的關(guān)系，我們進行了如下研究。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月—2019年12月寶雞市人民醫(yī)院收治的HDCP患者200例(觀察組)，年齡(29.35±5.12)歲。所有患者符合《婦產(chǎn)科學(xué)》(第8版)中關(guān)于HDCP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合HDCP診斷標(biāo)準(zhǔn)；②漢族，本地長期居?。虎蹎翁ト焉?；④既往無高血壓、糖尿病病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并妊娠期糖尿病、腎炎、肝內(nèi)膽汁淤積等并發(fā)癥者；②合并電解質(zhì)紊亂者；③合并內(nèi)分泌疾病、血液或免疫系統(tǒng)疾病者；④妊娠期服用ACE、AGT抑制劑或腎素抑制劑者。同期選擇在寶雞市人民醫(yī)院孕檢的健康孕婦200例(對照組)，年齡(28.91±5.42)歲。兩組年齡具有可比性。本研究經(jīng)寶雞市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象知情同意。

1.2 外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性檢測 所有研究對象入組后，采集清晨空腹肘靜脈血3 mL，置于含2% EDTA的抗凝管中。取標(biāo)本100 μL，加入紅細(xì)胞裂解液輕輕吹打混勻，冰浴裂解15 min，2 000 r/min離心3 min、離心半徑12 cm，棄上清，加入5% Chelez-100 200 μL充分混勻，56 ℃孵育20 min，2 000 r/min離心2 min、離心半徑12 cm，留取上清液，-20 ℃保存。取上清液60 μL，采用全自動核酸提取儀AU1001及其配套試劑提取DNA，經(jīng)UV7500雙光束紫外可見分光光度計鑒定，提取的DNA純度、濃度和完整性合格，可用于后續(xù)實驗。通過GenBank數(shù)據(jù)庫查找ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性，由上海天昊生物科技有限公司利用Premier5.0軟件設(shè)計引物。引物序列：ACE基因I/D上游引物5′-CCGATCTGGCAGAACCTC-3′，下游引物5′-GTGTTCCAGATCGTCTTC-3′；AGT基因M235T上游引物5′-GGTITGTGCAGGGCCTGGCTCT-3′，下游引物5′-AGGGTGCTGTCCACACCTGCTC-3′。按PCR擴增試劑盒說明配制反應(yīng)體系。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取上述PCR擴增產(chǎn)物10 μL，用限制性內(nèi)切酶MboII在37 ℃恒溫水浴鍋中酶切3 h，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳分離30 min，溴化乙錠染色，SNaPshot基因分型技術(shù)分析ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性。

1.3 血清ACE、AGT檢測 采集所有研究對象妊娠20～26周空腹肘靜脈血10 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min、離心半徑10 cm，取上層血清，-80 ℃保存。采用全自動酶標(biāo)儀ELISA法檢測血清ACE、AGT。ELISA試劑盒均購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。

1.4 資料收集與分析 所有研究對象入組后，收集其臨床資料，包括孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、被動吸煙例數(shù)、高血壓家族史、收縮壓、舒張壓、孕次、產(chǎn)次、TC、TG、肌酐(Cr)等。比較兩組上述臨床資料，將有統(tǒng)計學(xué)差異的臨床資料以及外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性納入多因素Logistic回歸模型，分析影響HDCP發(fā)病的危險因素。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性分布比較 兩組ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。兩組ACE基因I/D基因型分布和等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為7.071、5.183，P均<0.05)，AGT基因M235T基因型分布和等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為7.925、8.619，P均<0.05)。兩組外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型分布和等位基因頻率見表1、2。

表1 兩組ACE基因I/D基因型分布和等位基因頻率

表2 兩組AGT基因M235T基因型分布和等位基因頻率

2.2 HDCP患者外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T不同基因型者血清ACE、AGT水平比較 見表3、4。

表3 HDCP患者外周血ACE基因I/D不同基因型者血清ACE、AGT水平比較

表4 HDCP患者外周血AGT基因M235T不同基因型者血清ACE、AGT水平比較

2.3 影響HDCP發(fā)病的危險因素分析 觀察組孕前BMI(24.35±4.15)kg/m2，被動吸煙例數(shù)45例，有高血壓家族史32例，收縮壓(139.15±8.09)mmHg、舒張壓(76.32±6.12)mmHg，孕次(3.25±1.52)次，產(chǎn)次(2.53±0.61)次，TC(3.95±0.42)mmol/L，TG(1.91±0.35)mmol/L，Cr(13.26±3.26)μmol/L；對照組孕前BMI(21.05±3.02)kg/m2，被動吸煙例數(shù)21例，有高血壓家族史10例，收縮壓(116.43±5.03)mmHg、舒張壓(64.83±4.08)mmHg，孕次(3.29±1.53)次，產(chǎn)次(2.03±0.36)次，TC(3.91±0.31)mmol/L，TG(1.88±0.33)mmol/L，Cr(9.65±2.15)μmol/L。觀察組孕前BMI、被動吸煙例數(shù)、有高血壓家族史例數(shù)、收縮壓、舒張壓、產(chǎn)次、Cr均高于對照組(P均<0.05)，而兩組孕次、TC、TG比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

以是否患有HDCP為因變量，以孕前BMI、被動吸煙、高血壓家族史、收縮壓、舒張壓、產(chǎn)次、Cr及外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性為自變量，建立多因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，孕前BMI、被動吸煙、產(chǎn)次、ACE基因I/D多態(tài)性、AGT基因M235T多態(tài)性是HDCP發(fā)病的危險因素(P均<0.01)，見表5。其中，外周血ACE基因I/D多態(tài)性中攜帶DD基因型孕婦罹患HDCP的風(fēng)險是攜帶II基因型孕婦的1.324倍(95%CI：1.023～2.062，P<0.05)，外周血AGT基因M235T多態(tài)性中攜帶TT基因型孕婦罹患HDCP的風(fēng)險是攜帶MM基因型孕婦的1.905倍(95%CI：1.705～2.398，P<0.05)。

表5 影響HDCP發(fā)病的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

HDCP是妊娠期嚴(yán)重并發(fā)癥之一，以高血壓、蛋白尿、水腫為主要臨床表現(xiàn)。HDCP可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、胎兒宮內(nèi)窘迫、早產(chǎn)等并發(fā)癥，還能導(dǎo)致母體腦血管意外、臟器功能衰竭、休克甚至死亡[7]。HDCP是一種遺傳異質(zhì)性疾病，但其具體發(fā)病機制仍不完全清楚。因此，明確HDCP的候選基因?qū)ζ浞乐尉哂兄匾饬x。

RAS是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一，對心血管系統(tǒng)發(fā)育、心功能穩(wěn)態(tài)、電解質(zhì)平衡、血壓調(diào)控等均具有重要作用。有研究報道，RAS基因多態(tài)性與HDCP患者血壓、24 h壓力負(fù)荷動態(tài)變化有著密切聯(lián)系[8]。ACE、AGT作為RAS的重要組成部分，其基因多態(tài)性可能導(dǎo)致HDCP的發(fā)病風(fēng)險升高。ACE是RAS的關(guān)鍵酶，可調(diào)節(jié)血管收縮和血管舒張，維持機體正常血壓。ACE作用產(chǎn)物血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體是RAS作用于效應(yīng)器的關(guān)鍵成分，可發(fā)揮介導(dǎo)血管收縮、水鹽代謝、血管平滑肌增生等生理作用[9,10]。ACE基因定位于人染色體17q23，包括26個外顯子和25個內(nèi)含子，其第16內(nèi)含子上有一個287 bp的I/D多態(tài)性位點，該位點多態(tài)性已被證實與原發(fā)性高血壓、頑固性高血壓發(fā)病以及運動訓(xùn)練降壓效果等有關(guān)[11-12]。但ACE基因I/D多態(tài)性與HDCP關(guān)系的報道少見，且其結(jié)論存在一定爭議性。AGT是RAS的一種限速底物，經(jīng)腎素酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅰ(AngⅠ)，AngⅠ再經(jīng)ACE催化生成AngⅡ；AngⅡ通過調(diào)節(jié)血管收縮，增加醛固酮、去甲腎上腺素水平，促進血管平滑肌細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞激活，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成和高血壓發(fā)生[13]。AGT基因定位于人染色體1q42-43，含5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼血管緊張素前體多肽。AGT基因目前已發(fā)現(xiàn)50多個多態(tài)性位點，其中AGT基因2號外顯子704核苷酸處胸腺嘧啶被胞嘧啶代替可導(dǎo)致235號氨基酸由蛋氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸，該位點多態(tài)性被認(rèn)為與高血壓的發(fā)病密切相關(guān)。有研究報道，AGT基因M235T多態(tài)性與心血管疾病、終末期腎病存在一定相關(guān)性[14]。ZITOUNI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，AGT基因M235T多態(tài)性能夠增加子癇前期的發(fā)病風(fēng)險，并與子癇前期嚴(yán)重程度密切相關(guān)。但目前國內(nèi)鮮有AGT基因M235T多態(tài)性與HDCP關(guān)系的報道。

本研究兩組外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。觀察組外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型分布和等位基因頻率與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，說明ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性可能增加HDCP的發(fā)病風(fēng)險。有研究顯示，ACE基因I/D多態(tài)性與全身動脈性高血壓的發(fā)病風(fēng)險增加顯著相關(guān)[16]。本研究比較了HDCP患者外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T不同基因型者血清ACE、AGT水平差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血ACE基因I/D DD基因型者血清ACE、AGT水平高于DI、II基因型者，外周血AGT基因M235T TT基因型者血清ACE、AGT水平高于MM、MT基因型者，說明ACE、AGT基因多態(tài)性可能影響外周血循環(huán)中ACE、AGT水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ACE基因I/D多態(tài)性、AGT基因M235T多態(tài)性是HDCP發(fā)病的危險因素，其中外周血ACE基因I/D多態(tài)性中攜帶DD基因型孕婦罹患HDCP的風(fēng)險是攜帶II基因型孕婦的1.324倍，外周血AGT基因M235T多態(tài)性中攜帶TT基因型孕婦罹患HDCP的風(fēng)險是攜帶MM基因型孕婦的1.905倍。

綜上所述，外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多態(tài)性與HDCP的發(fā)病有關(guān)，攜帶ACE基因I/D DD基因型、AGT基因M235T TT基因型孕婦HDCP的發(fā)病風(fēng)險更高。