陶 磊，李婷婷，馬旖旎，陳仁兵，李雪芹，王金娜

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)，濟(jì)南 250031)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床最常見(jiàn)的急危重癥之一，其發(fā)病率約為30%，并且與患者的預(yù)后不良有關(guān)，主要表現(xiàn)為突然喪失腎排泄功能，腎功能急性惡化[1]。全球每年約有400萬(wàn)例死于AKI，且發(fā)病率和死亡率不斷攀升，造成嚴(yán)重的健康和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題[2]。目前認(rèn)為AKI是由于腎素血管緊張素系抑制劑和非甾體抗炎藥對(duì)腎進(jìn)、出小動(dòng)脈的收縮作用的干擾而導(dǎo)致的，而在加強(qiáng)利尿的情況下極易發(fā)生脫水，導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)改變，AKI情況進(jìn)一步惡化[3]。臨床上對(duì)于AKI提倡早發(fā)現(xiàn)、早治療，研究報(bào)道，對(duì)AKI進(jìn)行早期干預(yù)可以改善其預(yù)后，并降低腎功能進(jìn)一步惡化的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。國(guó)內(nèi)外對(duì)AKI的干預(yù)研究還處于探索階段[6]，因此，找到新的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞病理?yè)p傷的關(guān)鍵致病因素，其導(dǎo)致的病理?yè)p傷貫穿于多種腎病發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中。體內(nèi)氧化物質(zhì)增多、抗氧化物質(zhì)減少加重了腎細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，最終成為了腎病的發(fā)展及惡化的重要原因之一[7]。青蒿素的半合成衍生物青蒿琥酯(artesunate, ART) 是治療瘧疾的標(biāo)準(zhǔn)藥物, 而且還具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化應(yīng)激的作用[8]。本研究中采用阿霉素(adriamycin，ADR) 誘導(dǎo)大鼠腎損傷，觀察青蒿琥酯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎損傷的治療作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為臨床治療提供合理用藥依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠32只，體重220～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0006]。Wistar大鼠飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK (冀) 2018-001]，屏障環(huán)境溫度18℃～24℃，濕度40%～60%，飼料、飲水均經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查(IACUC-4thHos Hebum- 201968)，并依據(jù)優(yōu)化、減少、替代的 3R 原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2 主要試劑與儀器

青蒿琥酯(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào): H32020967)；鹽酸阿霉素(美國(guó)Med Chem Express公司)；組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Maleicdialdehyde， MDA)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒購(gòu)自于南京建成生物工程研究所；10%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司)。

全自動(dòng)生化分析儀LX20PRO(美國(guó)Beckman Coulter公司)；Synergy HT 型多功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó) Biotek公司)；防脫載玻片(北京索萊寶科技有限公司)；Tissue-Tek TEC 全自動(dòng)組織石蠟包埋機(jī)(日本櫻花公司)；IVS-410 自動(dòng)石蠟切片機(jī)(日本大和光機(jī)工業(yè)株式社)；CS-V1型攤片烤片機(jī)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；303-4A數(shù)顯電熱保溫箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；BX41光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Qcapture圖像采集系統(tǒng)(加拿大QIMAGING公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 阿霉素腎病模型的制備及分組

全部大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組(NC組)、阿霉素模型組(ADR組)、青蒿琥酯低劑量組(ART-L)和ART高劑量組(ART-H)，每組8只。ADR 組、ART-L組和ART-H組均經(jīng)大鼠尾靜脈注射阿霉素(7.5 mg/kg)[9]。造模第2天， ART-L組和ART-H分別給予25 mg/kg 和50 mg/kg的ART灌胃，連續(xù)灌胃3周，NC組給予等體積的生理鹽水。

1.3.2 一般情況

觀察內(nèi)容包括各組大鼠的飲食、飲水、體重、毛色、大小便、水腫、精神狀況，以及死亡情況。

1.3.3 大鼠尿蛋白、血清生化指標(biāo)的測(cè)定

分別于ART給藥1 周、2周、3周后，收集各組大鼠24 h 尿液，檢測(cè)尿總蛋白(UTP)；ART末次給藥24 h后，大鼠麻醉后，采用真空促凝采血管經(jīng)腹主動(dòng)脈采血3～5 mL，靜置后 3 000 r/min 離心 10 min，分離上層血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中白蛋白(ALB)、膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)和腎功能指標(biāo)血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)的含量。

1.3.4 腎組織病理學(xué)分析

大鼠腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、組織包埋后制成4 μm 厚石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

1.3.5 腎組織 SOD、GSH-Px 活力、MDA含量的測(cè)定

取部分腎組織，使用預(yù)冷的生理鹽水漂洗后，加入 9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，冰水浴中勻漿，4℃、2500 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

NC組大鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn)，皮毛順滑，行動(dòng)自如，眼、口、鼻無(wú)異常分泌物，尿便正常；阿霉素給藥后，大鼠出現(xiàn)精神萎靡，尿量不同程度下降，四肢水腫，體重減輕，毛欠光澤，禿頂，活動(dòng)力差，進(jìn)而出現(xiàn)紅色尿液、消瘦等癥狀；阿霉素給藥初期出現(xiàn)輕度腹瀉，1周后轉(zhuǎn)好；ART 組大鼠雖然也表現(xiàn)出體重下降，但毛色有光澤，活動(dòng)力尚可整理表現(xiàn)要優(yōu)于模型組，而ART-L組和ART-H組的大鼠體重相比無(wú)明顯差別，大鼠體重變化見(jiàn)圖 1。實(shí)驗(yàn)全程期間各組大鼠均無(wú)死亡情況。

2.2 ART對(duì)大鼠 24 h 尿液中UTP含量的影響

ADR模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h 尿總蛋白(UTP)含量均高于NC組。經(jīng)ART干預(yù)后，大鼠尿液中UTP含量有一定水平改善。結(jié)果可見(jiàn)，ART-L組及ART-H組較ADR組UTP含量明顯降低，ART-H組較ART-L組進(jìn)一步降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠體重變化Figure 1 Rat body weight changes in each group

表 1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn) 24 h UTP比較

2.3 ART對(duì)大鼠腎功能指標(biāo)的影響

表2分析結(jié)果可見(jiàn)，與NC組比較，ADR模型組大鼠血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)明顯升高。ART-L組和ART-H組兩指標(biāo)較ADR組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NC組比較，ADR組大鼠血清白蛋白(ALB)降低，ART-H組和ART-L組較ADR組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而各組大鼠血清膽固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果表明ART能改善ADR組大鼠的腎功能指標(biāo)。

2.4 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化比較

HE染色結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2)，NC組大鼠腎小管排列緊密，腎小管上皮細(xì)胞無(wú)明顯病變；與NC組相比，ADR組大鼠腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性，部分細(xì)胞崩解、細(xì)胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成； ART干預(yù)后，各病理癥狀明顯好轉(zhuǎn)，低劑量組大鼠可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性，看見(jiàn)少量細(xì)胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成，可見(jiàn)再生；高劑量組可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性，刷毛緣脫落，可見(jiàn)明顯再生。以上病理結(jié)果表明ART能改善腎組織損傷程度，明確了ART對(duì)阿霉素致大鼠腎損傷的治療效果。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 ART對(duì)大鼠腎組織 SOD、GSH-Px活力、MDA水平的影響

由表3可見(jiàn)，與NC組比較，ADR組大鼠腎組織 SOD、GSH-Px活力降低，而MDA含量升高(均P<0.05);與ADR組比較，ART-L組和ART-H組大鼠腎組織SOD、GSH-Px活力升高，MDA含量降低(均P<0.05)。

3 討論

ADR是一種常用的抗癌藥物。然而，其在正常組織，包括心臟和腎中的副作用限制了其臨床應(yīng)用[10]。ADR引起的急性腎損傷模型是一個(gè)成熟的和高重復(fù)性的腎病模型。AKI以管狀細(xì)胞壞死為主要病理特征，所涉及的發(fā)病機(jī)制包括炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡等[11-12]，其中，氧化應(yīng)激是由促氧化水平和對(duì)抗抗氧化防御機(jī)制之間的失衡導(dǎo)致的。研究表明ADR誘導(dǎo)的AKI與抗氧化狀態(tài)加劇有關(guān)，包括脂質(zhì)過(guò)氧化最終產(chǎn)物丙二醛(MDA) 含量升高和腎組織中抗氧化酶水平降低，從而導(dǎo)致了腎代謝途徑的改變和腎血流動(dòng)力學(xué)中斷[13]。ART是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的應(yīng)用于抗瘧疾治療的一線藥物，以往的研究表明，ART還具有很好的抗炎、抗腫瘤以及抗病毒等療效[14]，此外，ART能夠抑制抗氧化防御系統(tǒng)中非酶性和酶性成分活性，即GSH和SOD的水平降低，從而降低了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[15-16]。對(duì)于ART能否通過(guò)降低了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷來(lái)改善ADR所致的腎損傷，需要進(jìn)一步研究探討。

注: A：NC組；B：ADR組；C：ART-L組；D：ART-H組。圖2 大鼠腎的病理學(xué)改變Note. A, NC group. B, ADR group. C, ART-L group. D, ART-H group.Figure 2 Pathological changes of the kidney tissues in rats

表 3 各組大鼠腎組織 SOD、MDA和GSH-Px 水平比較

本研究利用ADR誘導(dǎo)的AKI大鼠模型探討ART對(duì)AKI大鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。研究結(jié)果顯示，與NC組相比，ADR組大鼠UTP及血清BUN、Scr水平升高，同時(shí)ADR組腎病粒結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷，腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性，部分細(xì)胞崩解、細(xì)胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成，符合急性腎損傷表現(xiàn)[11,17]。與ADR 組相比，ART-H組和ART-L組血清BUN、Scr水平明顯下降，受損的腎生理結(jié)構(gòu)部分得到恢復(fù)，這表明ART能夠改善腎功能和腎組織的損傷。腎組織中 SOD、GSH-Px 活力和MDA水平可反映ADR處理后誘導(dǎo)的腎氧化和抗氧化狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠腎組織 GSH-Px 和 SOD 活力下降，MDA 水平升高，說(shuō)明ADR可以造成腎組織的氧化和抗氧化狀態(tài)的改變，抗氧化酶水平下降，而脂質(zhì)過(guò)氧化物水平升高。與ADR組相比，ART-H組和ART-L組的SOD和GSH-Px 活力都明顯升高，而MDA 水平明顯下降。結(jié)果提示，ART可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量增加，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的一致[18]。

綜上所述，AKI能明顯改善ADR誘導(dǎo)的大鼠腎損傷, 其作用機(jī)制可能與AKI對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)有關(guān)，而在此過(guò)程中涉及一些信號(hào)通路的激活，在以往的文獻(xiàn)中均有報(bào)道[19-21]，但還需要本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AKI對(duì)ADR誘導(dǎo)的大鼠腎損傷的保護(hù)作用，從而為ADR腎損傷的臨床預(yù)防及治療提供了理論依據(jù)。