謝 翼，王 凱，牛 敏

(1.山東省淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255034； 2.山東省日照市人民醫(yī)院， 山東 日照 276800)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是老年病人手術后出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，表現(xiàn)為精神錯亂、焦慮、人格的改變以及記憶受損。目前POCD機制尚未明了，研究方向主要集中在中樞膽堿能系統(tǒng)功能障礙、炎癥反應、神經(jīng)細胞凋亡等領域[1-2]。

自噬(autophagy)是細胞內容物分解代謝的過程，作為一種高度調節(jié)的細胞機制，與多種疾病的生理病理情況有關[3]。近年來研究表明[4-5]，上調自噬水平可能保護神經(jīng)退行性變，調節(jié)自噬可能成為治療阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的新策略。還有研究表明，麻醉誘導應激可能導致海馬水平的改變和認知障礙[6]。本實驗將老年大鼠暴露于七氟醚后，采用Morris水迷宮，Western blot檢測自噬及凋亡相關蛋白表達等方法，證實了海馬區(qū)自噬在七氟醚麻醉誘導的神經(jīng)退行性變中起作用，為POCD的治療提供了一個新的潛在靶點及理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

72只SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，20月齡，體重550～750 g，購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司[SCXK(魯)2019-0011]。實驗前適應性飼養(yǎng)在淄博市中心醫(yī)院[SYXK(魯)2017-0023)]一周，室溫(22±2)℃，所有大鼠均自由攝食、飲用蒸餾水，維持12 h光照和12 h黑暗交替循環(huán)的環(huán)境。本研究獲得本院動物倫理委員會批準(20190623)，依據(jù)3R原則進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(山東，魯南貝特制藥有限公司)；雷帕霉素、氯喹(美國，Sigma公司)；p-mTOR、mTOR、Bcl-2、Cl-Caspase3、p-S6K1、S6K1抗體(美國，Novus Biologicals公司)；Bax、p62抗體(美國，Abcam公司)；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(南京，凱基生物工程公司)； Maxima SYBR Green及cDNA 合成試劑盒(美國，Thermo 公司)；透射電子顯微鏡(日本，HT7800)；電泳儀(北京六一，DYCZ-24DN)；血氣分析儀(丹麥，ABL80)；大鼠Morris水迷宮(上海欣軟，water Maze)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及模型建立

大鼠隨機分為6組(每組12只)：對照組(CON)、雷帕霉素組(RAP)、氯喹組(CQ)、七氟醚組(SEV)、七氟醚+雷帕霉素組(SEV+RAP)、七氟醚+氯喹組(SEV+CQ)。雷帕霉素和氯喹分別用二甲基亞砜溶解并稀釋制成25 mg/mL的溶液，再用5%的聚乙二醇400和5%吐溫80溶液進一步稀釋成10 mg/mL的溶液。RAP與SEV+RAP組于麻醉前靜脈注射20 mg/(kg·d)的雷帕霉素，CQ和SEV+CQ組于麻醉前靜脈注射20 mg/(kg·d)氯喹，均連續(xù)7 d。CON和SEV組靜脈注射等體積的空白溶劑。大鼠放入麻醉箱后，SEV、SEV+RAP與SEV+CQ組開啟2%七氟醚和30% O2混合氣，連續(xù)麻醉5 h；CON、RAP與CQ組大鼠開啟30% O2連續(xù)5 h。

1.3.2 生理指標分析

實驗結束后，每組隨機選3只大鼠抽取1 mL動脈血，使用血氣分析儀觀察pH值、PaCO2、PaO2、SaO2及血糖指標變化。

1.3.3 行為學測試

七氟醚暴露24 h后，采用Morris水迷宮測試大鼠的空間記憶能力，平臺(直徑10 cm)固定在游泳池的四個象限之一。連續(xù)訓練5 d，每天4次。將平臺被淹沒在水下1 cm處，每一次實驗時，觀察大鼠在水中找到平臺并爬上平臺的時間，記為逃避潛伏期；如果在120 s內不能找到平臺，則人為將其引導到平臺，并停留10 s，將逃避潛伏期記為120 s；當老鼠到達平臺時，他們被允許在上面休息30 s；記錄找到隱藏平臺所需的時間(逃避潛伏期)。四次的平均時間為大鼠當日的結果。每次實驗后，老鼠被擦干，然后放回籠子。第5天，在去除平臺后進行空間探索實驗，記錄120 s內老鼠穿過原平臺位置的次數(shù)和在目標象限的停留時間。

1.3.4 取材

Morris水迷宮測試結束后，將所有大鼠麻醉處死，每組將3只大鼠取出全腦，切除腦海馬組織，左側用于TEM觀察，右側用于TUNEL分析。其它9只大鼠快速剝離海馬，切除雙側海馬組織，迅速置于液氮冷凍，用于Western blot和RT-qPCR分析。

1.3.5 TEM觀察海馬神經(jīng)元自噬

取左側海馬組織，置于2.5%戊二醛中，4℃固定過夜，磷酸緩沖鹽沖洗三次，1%鋨酸固定2 h，水沖洗，常規(guī)脫水，包埋，切片，經(jīng)4%乙酸鈾染色20 min、0.5%檸檬酸鉛染色5 min，鏡下觀察海馬神經(jīng)元自噬體。

1.3.6 TUNEL法檢測海馬細胞凋亡

按TUNEL試劑盒使用說明書進行操作，于顯微鏡下觀察，計數(shù)海馬CA1區(qū)的凋亡細胞(凋亡細胞細胞核呈棕色)及細胞總數(shù)，其比值即為相對細胞凋亡率[7]。

1.3.7 RT-qPCR檢測海馬組織中LC3 mRNA表達

取海馬組織[8]，加入TRIzol試劑提取待測組織總RNA，以提取的總RNA為模板按逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，取 2 μL cDNA用于 RT-qPCR 反應。β-actin上游引物：5’-AGCACAGAGCCTCGC CTTT-3’；下游引物：5’-AGGGTGAGGATGCCTCTC TT-3’；LC3上游引物5’-AGCAGCATCCAACCA AAATC-3’； 下游引物：5’-CTGTGTCCGTTC ACCAACAG-3’)，以β-actin作為內參，根據(jù)公式mRNA=2-△△Ct計算分析海馬組織中基因的相對表達水平。

1.3.8 Western blot法檢測海馬組織中p-S6K1、Cl-Caspase3、p62、p-mTOR、Bax、Bcl-2蛋白表達水平

取50 mg海馬組織加入適量的RIPA裂解液，勻漿后，離心10 min，收集上清液，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。然后上樣、電泳、轉膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，加一抗4℃孵育過夜，加二抗37℃孵育2 h，TBST漂洗，ECL顯色。采用Image圖像軟件對蛋白質條帶進行分析，目的蛋白與β-actin密度的比值作為目的蛋白的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組生理指標分析結果

在七氟醚麻醉或假暴露結束時，對每組3只大鼠的動脈血樣進行血氣及血糖分析。與對照組比較，其余實驗組血樣中pH、PaCO2、PaO2、葡萄糖、SaO2值無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

2.2 Morris水迷宮測試各組大鼠行為學結果

與CON組比較，SEV組大鼠逃避潛伏期延長(P<0.01)，目標象限時間百分比下降(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.01)；與SEV組比較，SEV+RAP組逃避潛伏期縮短，目標象限時間百分比增加、穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)；而SEV+CQ組逃避潛伏期延長，目標象限時間百分比下降、穿越平臺次數(shù)減少減少(P<0.05)；CON和RAP組、CON和CQ組大鼠逃避潛伏期、目標象限時間百分比、穿越平臺次數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，見圖1A、1B、1C。

表1 各組老年大鼠動脈血氣比較Table 1 Comparison of arterial blood gas of aged rats in each group

2.3 TEM觀察大鼠海馬神經(jīng)元自噬變化

與CON組比較，RAP、CQ及SEV組的海馬神經(jīng)元自噬泡數(shù)量增加(P<0.05)；與SEV組比較，SEV+RAP和SEV+CQ組自噬泡數(shù)量也增加(P<0.05)，CQ和SEV+CQ兩組間自噬泡數(shù)量無顯著性差異(P>0.05)，見圖2。

2.4 TUNEL法染色觀察神經(jīng)元凋亡情況

與CON比較，SEV組細胞凋亡率增加(P<0.01)，RAP、CQ組無顯著差異(P>0.05)；與SEV比較，SEV+CQ組的細胞凋亡率增加，SEV+RAP組降低(P< 0.05)，見圖3。

2.5 RT-qPCR檢測大鼠LC3 mRNA的表達

與CON組比較，RAP組 LC3 mRNA表達水平升高(P< 0.01)；與SEV組比較，SEV+RAP組 LC3 mRNA表達水平升高(P< 0.01)，見圖4。

2.6 Westernblot檢測海馬p62、Bcl-2、Cl-caspase-3、Bax、p-mTOR、p-S6K1蛋白表達

與CON組比較，SEV組的p62、Cl-caspase-3和Bax表達升高(P<0.05)，Bcl-2表達降低(P<0.01)。與SEV組比較，SEV+RAP組p62、Cl-caspase-3和Bax表達降低(P<0.05)，Bcl-2表達升高(P<0.01)，p-mTOR、p-S6K1表達下降(P<0.01)，而SEV+CQ組p62、Cl-caspase-3和Bax 表達升高(P<0.05)，Bcl-2表達降低(P>0.05)，見圖5。

注：與七氟醚組比較，**P<0.01，*P<0.05；與對照組比較，#P>0.05。下同。圖1 各組大鼠行為學結果Note. Compared with SEV group, **P<0.01,*P<0.05. Compared with CON group,#P>0.05. The same as below.Figure 1 Behavioral results of rats in each group

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元自噬泡數(shù)量比較Figure 2 Comparison of autophagy of hippocampal neurons in each group

圖3 各組大鼠海馬細胞凋亡率Figure 3 Apoptosis ratio of cells in the hippocampus of rats in each group

圖4 七氟醚麻醉后大鼠海馬LC3 mRNA表達 情況Figure 4 Effect of sevoflurane anesthesia on LC3 mRNA expression in rats

圖5 七氟醚麻醉后對大鼠海馬區(qū)相關因子表達的 影響Figure 5 Effects of sevoflurane anesthesia on the expression of related factors in hippocampus of rats

3 討論

POCD是術后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，盡管人們已經(jīng)普遍認識到POCD的危害性，但其具體的發(fā)病機制、病理生理還未被闡明。七氟醚是臨床常用的吸入性麻醉藥，對術后認知功能有影響，但發(fā)生機制尚不明確。研究表明，七氟醚吸入麻醉引起老年患者POCD發(fā)生率高于靜脈注射異丙酚的老年患者[8]。本實驗對大鼠生理指標檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各實驗組生理指標值均無顯著性差異(P>0.05)，這說明七氟醚預處理對大鼠生理改變無明顯影響。

由于雄性大鼠比較強壯，雌性體質相對比較弱，容易有別的因素(吃的食物，生活環(huán)境等)干擾實驗效果，因此選擇雄性大鼠進行實驗。海馬組織主要負責存儲信息，是人學習和記憶的關鍵功能區(qū)認知區(qū)域之一。病理研究表明，當發(fā)生輕度認知功能障礙時，海馬具有神經(jīng)可塑性[9]。Morris水迷宮是研究海馬空間學習記憶的重要評估工具[10]。本實驗水迷宮結果顯示，七氟醚麻醉后老年大鼠出現(xiàn)了認知障礙，而RAP、CQ組大鼠空間學習記憶能力無明顯差別，提示RAP、CQ分別單獨給藥對老年大鼠認知功能無影響。與SEV組比較，SEV+RAP組大鼠認知障礙明顯改善，說明雷帕霉素治療可以改善七氟醚引起的認知障礙。而SEV+CQ組則進一步加劇了七氟醚誘導引起的認知功能障礙，提示七氟醚麻醉導致大鼠空間記憶的損害可能與海馬自噬有關。

自噬是細胞在應激狀態(tài)下再利用的重要分解代謝過程，在維持細胞穩(wěn)態(tài)和應激狀態(tài)下保留細胞生存能力方面發(fā)揮重要作用[11]。微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是存在于哺乳動物體內的自噬基因，其表達水平在某種程度上反映了細胞的自噬活性[12]；p62包含多種蛋白作用域，可結合聚泛素化蛋白并將其進一步降解，通常細胞內 P62 蛋白的水平與自噬活性的強弱呈負相關性[13-14]。Western blot結果顯示，與CON組相比，SEV組p62蛋白表達上升(P<0.05)，而SEV+RAP組p62表達低于SEV組(P<0.05)，這說明七氟醚能抑制老年大鼠自噬通道。同時TEM觀察顯示，SEV+CQ、SEV+RAP組的自噬泡數(shù)量高于SEV組，而CQ和SEV+CQ組的自噬泡數(shù)量則無顯著性差異，這些證據(jù)進一步表明七氟醚誘導老年大鼠海馬自噬受損。RT-qPCR結果顯示，CQ組及SEV+CQ組對LC3 mRNA影響不大，但雷帕霉素(RAP)提高了LC3 mRNA水平，且TUNEL法觀察發(fā)現(xiàn)SEV+RAP組海馬神經(jīng)元凋亡率較SEV組下降(P<0.05)，這說明雷帕霉素上調LC3 mRNA表達從而增加自噬活性，維持細胞內穩(wěn)態(tài)，阻止細胞凋亡。mTOR是一個重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在進化上非常保守，它對細胞自噬起著負調控作用，而S6K1是mTOR下游效應分子之一。Westernblot結果顯示，與CON組相比，RAP顯著抑制p-mTOR及其下游p-S6K1表達(P<0.01)，而SEV+RAP組p-mTOR和p-S6K1表達較SEV組表達下調，我們推測雷帕霉素可能通過抑制mTOR途徑減少p-S6K1的積累，增強了自噬，而SEV可能通過激活mTOR通路，起到抑制自噬的作用。

研究指出，七氟醚麻醉可以引起老年大鼠內質網(wǎng)應激反應，內質網(wǎng)中未折疊蛋白的過度積累會引起內質網(wǎng)應激，損傷細胞器，誘導細胞進入凋亡程序[15]。Bcl 2蛋白家族和胱天蛋白酶(Caspase)家族在細胞凋亡過程中起著關鍵性作用，其中Bcl 2抑制細胞凋亡，而Bax為促凋亡因子，Caspase-3是凋亡級聯(lián)反應中處于核心地位的蛋白，通過三者表達的變化可判斷細胞凋亡[16]。Western blot結果顯示，七氟醚麻醉后大鼠Bcl-2水平顯著降低，Caspase-3和Bax水平顯著升高，TUNEL法染色觀察到七氟醚麻醉后海馬相對細胞凋亡率明顯增加，驗證了七氟醚麻醉能誘導細胞凋亡；而雷帕霉素預給藥后，與SEV組大鼠比較，Bcl-2水平顯著升高，Caspase-3、Bax水平及細胞凋亡率均明顯降低，提示自噬可能通過阻斷凋亡，從而促進細胞存活。

綜上所述，七氟醚麻醉后可顯著損害老年大鼠記憶能力，誘導海馬神經(jīng)元凋亡，而聯(lián)合雷帕霉素治療則可以改善七氟醚誘導的自噬通道受損。這些發(fā)現(xiàn)表明，七氟醚麻醉導致老年大鼠認知功能障礙與海馬神經(jīng)元的自噬受損有關。