趙 軍，褚亞君，梁晉裕，付 芳

(1.晉中學(xué)院體育系，山西 晉中 030619； 2.中北大學(xué)體育學(xué)院，太原 030051)

糖尿病是一種以慢性高血糖和胰島素分泌缺陷為主要癥狀的最常見的代謝性疾病之一，其發(fā)病率呈上升趨勢，到2030年，全球約有3.66億人將受到影響[1]。認知功能障礙是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一。Rama等[2]研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者的學(xué)習(xí)能力和記憶鞏固處理能力減弱，抽象判斷能力不足，導(dǎo)致患癡呆的風(fēng)險增大。動物實驗表明STZ可引起大鼠認知障礙和記憶喪失[3]。然而，1型糖尿病認知功能下降的病理生理機制尚不清楚。

有學(xué)者研究認為，高血糖可導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)功能紊亂、增加促炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和c反應(yīng)蛋白(CRP)的過度釋放，與高血糖引起的認知功能下降有關(guān)[4]。海馬體是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，對高血糖及炎性細胞因子非常敏感。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)在神經(jīng)元存活、軸突的生長和突觸的形成方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，被視為認知障礙的治療靶點[5]。Cai等[6]研究發(fā)現(xiàn)，促炎因子活性增加可能會通過降低大鼠海馬NGF及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平，與異氟醚麻醉后大鼠認知功能障礙有關(guān)，而腦室注射NGF可通過增強大腦抗炎因子活性改善與年齡相關(guān)的空間學(xué)習(xí)能力的缺失[7]。

有氧運動被認為是緩解糖尿病癥狀和改善認知功能的良好策略。研究表明，有氧運動可降低海馬炎性細胞因子如IL-6和TNF-α水平[8]。運動可通過不同機制影響大腦，而運動對神經(jīng)營養(yǎng)因子包括NGF的影響是最重要的機制之一[9]。本研究通過測量跑臺運動8周對STZ誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，檢測大鼠海馬炎癥因子(TNF-α 及IL-6)及NGF表達的變化，探討長期跑臺運動是否可改善1型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力并分析其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

3月齡SPF級雄性健康成年SD大鼠44只，購于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(晉)2019-0004]，體重200～220 g，室溫22～24 ℃，濕度55～65%，所有動物均在山西醫(yī)科大學(xué)動物房飼養(yǎng)[SYXK(晉)2019-0007]。本實驗中涉及動物的使用及操作按3R原則給與動物人道關(guān)懷，并經(jīng)學(xué)校實驗動物管理倫理委員會批準(1401086000735)，符合國家實驗動物福利相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

STZ(鏈脲佐菌素，美國Sigma公司提供)；TNF-α、IL-6 試劑盒、兔抗NGF多克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG、SABC 及DAB 顯色試劑盒均由武漢博士德生物有限公司提供。血糖測量儀和試紙均購自美國強生公司；恒溫培養(yǎng)箱(YLA-2000 型，上海陽光實驗儀器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(CX31型，日本 Olympus公司)；形態(tài)學(xué)圖像分析軟件(型號：JD- 801)，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠1型糖尿病模型建立

所有大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機抽取22只大鼠為對照組(control group，CG；n=11)及運動組(exercise group，EG；n=11)，其余22只大鼠一次性腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.5)65 mg/kg，注射STZ后3 d，使用血糖儀從大鼠尾靜脈取血測量血糖水平，血糖超過16.7 mmol/L的大鼠為糖尿病大鼠。將22只糖尿病大鼠隨機分為STZ組(n=11)及STZ運動組(STZ+exercise group，STZ+E；n=11)，隨后運動組及STZ運動組大鼠進行8 周跑臺運動，實驗期間每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、進食、飲水及尿便情況，跑臺運動結(jié)束后第2天測量大鼠血糖水平，以血糖升高較對照組明顯升高為判斷模型成功標(biāo)準。

1.3.2 跑臺運動方案

根據(jù)Reisi等[10]描述的方法，造模成功后第2天，運動組及STZ+E組大鼠進行為期8周(5天/周，0坡度)的跑臺運動。跑臺訓(xùn)練前5 d跑臺速度逐漸從5 m/min增加到15 m/min；第2周，跑臺速度從16 m/min增加到22 m/min，以后每周跑速增加2 m/min，每次運動時間持續(xù)40 min，連續(xù)8 周。與此同時，對照組及STZ組不運動，正常實驗室環(huán)境飼養(yǎng)8 周。

1.3.3 電Y迷宮實驗程序

跑臺運動結(jié)束后第2天所有大鼠進行電Y迷宮實驗。

電Y迷宮實驗由相同的三個臂組成(均裝有15 W燈泡和電網(wǎng))。實驗時，先將大鼠放入迷宮適應(yīng)3～5 min，然后訓(xùn)練大鼠電刺激還末開始時，只要安全區(qū)燈亮，大鼠就會立即逃往安全區(qū)的反應(yīng)能力；動物受電擊逃到安全區(qū)后，刺激信號燈繼續(xù)作用10～15 s，燈熄后結(jié)束一次測試，大鼠所在支臂作為下一次測試的起點，依次重復(fù)。兩次測試時間間隔為30 s，每次訓(xùn)練20次休息5 min，連續(xù)測試直到學(xué)會為止(學(xué)會標(biāo)準：連續(xù)20次測試中有18次正確)，記錄每只大鼠達到學(xué)會標(biāo)準前所需的訓(xùn)練次數(shù)為大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶成績；學(xué)習(xí)測試結(jié)束后24 h，再用同樣方法測試大鼠的記憶能力，記錄大鼠30次電擊過程中出現(xiàn)的錯誤次數(shù)，錯誤次數(shù)越少，說明記憶力越好。

觀察指標(biāo)如下：(1)達到標(biāo)準所需的訓(xùn)練次數(shù)；(2)30次電擊過程中出現(xiàn)的錯誤次數(shù)。

1.3.4 海馬炎癥細胞因子水平測量

Y迷宮測試結(jié)束后即刻將每組6只大鼠斷頭取腦，冰生理鹽水沖洗干凈后迅速分離海馬稱重，并用生理鹽水按(1∶9)的比例制成10% 的組織勻漿，離心(12000 r/min，10 min)后取上清液，采用ELISA法，參照試劑盒說明進行海馬炎癥因子IL-6及TNF-α水平的測定。

1.2.5 海馬NGF免疫組化檢測

Y迷宮測試結(jié)束后即刻，每組剩余5只大鼠經(jīng)麻醉后，4%多聚甲醛溶液心臟灌注取腦，石蠟包埋腦組織，海馬經(jīng)石蠟切片機連續(xù)冠狀切片(片厚5 μm)，切片依次經(jīng)梯度乙醇脫蠟、脫水后滴加30% H2O2室溫孵育30 min，PBS液漂洗3次后滴加兔抗大鼠NGF(1∶200)，4℃過夜，PBS液漂洗3次后滴加生物素化羊抗兔NGF二抗孵育(37℃、30 min)，PBS液清洗后DAB室溫顯色10 min，蘇木素復(fù)染2～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

每組海馬每個區(qū)選取10張切片，每張切片取5個視野采集圖像，計數(shù)海馬CA1、CA2、CA3及DG 區(qū)NGF陽性細胞數(shù)(number)及面積(μm2)，取其平均值作為最后結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮結(jié)果

與對照組比較，STZ 組大鼠達到學(xué)會標(biāo)準訓(xùn)練次數(shù)顯著增加(P<0.01)，運動組大鼠訓(xùn)練次數(shù)顯著減少(P<0.05)，而STZ運動組大鼠與對照組比較，訓(xùn)練次數(shù)無顯著差異(P<0.05)；與STZ組大鼠比較，STZ 運動組大鼠達到學(xué)會標(biāo)準訓(xùn)練次數(shù)顯著下降(P<0.05)。見表1。

與對照組比較，STZ 組及STZ 運動組大鼠30次錯誤次數(shù)均顯著增加(P<0.01)，而運動組大鼠與對照組比較，30次錯誤次數(shù)無顯著差異(P>0.05)；與STZ組比較，STZ 運動組大鼠30次錯誤次數(shù)顯著下降(P<0.05)。見表1。

表 1 各組大鼠Y迷宮測試結(jié)果Table 1 Results of Y-maze test in every group rats

2.2 海馬炎癥因子結(jié)果

與對照組比較，STZ組大鼠海馬炎癥因子IL-6及TNF-α水平均明顯增加(P<0.01)；而經(jīng)過8 周跑臺運動，與STZ 組大鼠比較，STZ運動組大鼠海馬促炎因子TNF-α水平顯著減少(P<0.05)，而IL-6水平無顯著改變(P>0.05)；與對照組比較，運動組大鼠海馬促炎因子 IL-6及TNF-α水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

2.3 海馬NGF表達結(jié)果

與對照組比較，STZ組大鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)NGF個數(shù)和面積均明顯下降(P<0.01)。經(jīng)過8周跑臺運動，與STZ組大鼠比較，STZ運動組大鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)NGF個數(shù)和面積均明顯增加(P<0.05，P<0.01)；而STZ組大鼠海馬CA2區(qū)NGF個數(shù)和面積與對照組及STZ運動組大鼠比較均無顯著差異(P>0.05)。與對照組比較，運動組大鼠除海馬DG區(qū)NGF面積顯著高于對照組外(P<0.05)，海馬DG區(qū)NGF個數(shù)及海馬其他3區(qū)NGF個數(shù)和面積與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)。見表3、表4、圖1。

3 討論

糖尿病被認為是認知功能障礙發(fā)展的一個獨立危險因素[11]。研究發(fā)現(xiàn)，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者認知功能障礙的風(fēng)險增加1.5倍，癡呆風(fēng)險增加1.6倍[12]。Liu等[13]通過認知量表研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者空腹血糖水平升高與認知功能下降有關(guān)。Li等[14]通過Y迷宮的自發(fā)性交替反應(yīng)證實，高脂飲食及STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠存在學(xué)習(xí)記憶障礙。Oliveira等[15]通過T迷宮實驗也觀察到了連續(xù)2 d腹腔注射STZ(90 mg/kg)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠出現(xiàn)記憶缺陷。本研究使用Y迷宮試驗證實，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在Y迷宮中表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)及記憶缺陷，具體表現(xiàn)為與對照組比較，STZ 組大鼠

表2 各組大鼠海馬炎癥因子IL-6及TNF-α 水平結(jié)果Table 2 Results of the hippocampus inflammatory biomarkersin every group rats

表3 各組大鼠海馬CA1、CA2區(qū)NGF表達結(jié)果Table 3 Results of NGF expression in the hippocampus CA1 and CA2 of rats

表4 各組大鼠海馬CA3、DG區(qū)NGF表達結(jié)果Table 4 Results of NGF expression in the hippocampus CA3 and DG of rats

注：A1-D4: 冠狀切面顯示大鼠海馬CA1、CA2、CA3及DG區(qū)NGF表達(箭頭所指)。圖1 NGF免疫組化檢測結(jié)果Note. A1-D4, Coronal sections showing the NGF expression (arrows) in the hippocampus CA1, CA2, CA3 and DG of the rats．Figure 1 Results of NGF immumohistochemical staining

達到學(xué)會標(biāo)準的訓(xùn)練次數(shù)及30次電擊過程中出現(xiàn)的錯誤次數(shù)均顯著增多。研究認為，運動可以減輕糖尿病引起的并發(fā)癥，并對認知功能產(chǎn)生有益的影響，在預(yù)防神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[16]。Kim等[17]對出生后4 周的糖尿病幼鼠進行2 周跑臺運動(5次/周，30 分/次)干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)跑臺運動可通過增加海馬齒狀回細胞增殖和抑制凋亡減輕STZ對幼鼠短期記憶的損傷。本研究得到相同結(jié)果，與STZ組大鼠比較，STZ 運動組大鼠達到標(biāo)準的訓(xùn)練次數(shù)及30次錯誤次數(shù)均顯著下降，提示，長期跑臺運動可改善糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

神經(jīng)炎癥被認為是認知能力下降、癡呆等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的公認因素[18]。研究表明，1型和2型糖尿病患者CRP、TNF-α 及 IL- 6水平均顯著上調(diào)，與糖尿病患者認知能力下降和癡呆的發(fā)展有關(guān)[19]。Yaffe等[20]人報道，血清CRP和IL-6水平升高的糖尿病患者存在認知功能受損，而血清CRP和IL-6水平正常的糖尿病患者認知功能正常，說明糖尿病患者促炎因子水平升高與認知功能受損密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，STZ可導(dǎo)致大鼠海馬促炎因子IL-6和TNF-α 水平顯著增加，與Liu等[21]研究結(jié)果一致。越來越多的證據(jù)表明，運動可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥減輕神經(jīng)退行性病變，增強大腦功能，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[22]。Chennaoui等[23]研究發(fā)現(xiàn)，7 周遞增負荷跑臺運動(18～25 m/min，60～120 分/次)可增強正常大鼠海馬TNF-α及IL-6蛋白含量。但本研究發(fā)現(xiàn)，8 周跑臺運動(16 m/min到22 m/min，持續(xù)時間40 min)對正常大鼠海馬TNF-α 和IL-6水平無顯著影響，這種差異可能與運動強度及持續(xù)時間有關(guān)。Wannamethee等[24]對4252名受試者(60～79歲)研究發(fā)現(xiàn)，體育鍛煉水平與促炎因子(CRP及TNF-α 等)呈顯著負相關(guān)。Andrade等[25]研究發(fā)現(xiàn)，8 周游泳運動(60 min/d，5次/周)可使高脂肪飲食和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠TNF-α水平及IL-6水平下降、抗炎因子IL-10水平增加。此外，Jahangiri等[26]發(fā)現(xiàn)，9 周跑臺運動(15 m/min, 30 min/d)可通過下調(diào)海馬TNF-α、IL-1β及 CRP水平，從而起到保護神經(jīng)、促進大腦修復(fù)的作用，改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8 周遞增負荷跑臺運動，與STZ組比較，STZ運動組大鼠海馬促炎因子TNF-α 水平顯著下降，但對促炎因子IL-6水平無顯著影響，說明此運動具有一定的抗神經(jīng)炎癥作用。因此本研究8 周跑臺運動改善STZ大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與此運動抑制STZ導(dǎo)致的海馬神經(jīng)促炎因子的釋放有關(guān)，具體機制需進一步研究。

NGF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、存活和分化，并參與突觸可塑性。NGF是胰腺細胞合成和分泌胰島素的重要調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)STZ導(dǎo)致的大鼠學(xué)習(xí)記憶下降中起著關(guān)鍵作用[27]。STZ對糖尿病大鼠海馬NGF水平變化的研究存在爭議。Gürbüz等[28]采用ELISA法測定海馬組織勻漿NGF的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，STZ誘導(dǎo)的青春期1型糖尿病幼鼠(出生后28 d)海馬NGF水平無顯著改變。而Zhang等[29]通過Western blot法測定海馬NGF的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬NGF水平顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)，海馬是由相互聯(lián)系的CAl、CA2、CA3及DG區(qū)等多個區(qū)域組成，且海馬CAl、CA3和DG區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中擔(dān)負著尤其重要的作用[30]。本研究通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)NGF表達均顯著下降，但是海馬CA2區(qū)NGF表達無顯著變化，經(jīng)過8周跑臺運動，與糖尿病大鼠比較，糖尿病運動組大鼠海馬NGF表達顯著增加。最近研究報道，NGF與其受體(TrkA)結(jié)合可激活抗炎信號通路，增強抗炎物質(zhì)IL-10等的釋放降低炎癥反應(yīng)[31]。因此，本實驗中跑臺運動改善STZ大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與此運動增加海馬CA1、CA3及DG區(qū)NGF水平，增強海馬抗炎能力，從而糾正STZ誘導(dǎo)的海馬功能紊亂起到腦保護作用有關(guān)。但是，跑臺運動導(dǎo)致STZ大鼠海馬抗炎能力增強是否與NGF的增加有關(guān)，仍需要進一步研究證實。