曾宋君 郭貝怡 孔鑫平 房林 李琳 陳硯 符穩(wěn)群 吳坤林

摘? 要：由于生境破壞和人工過度采挖及繁殖的障礙，兜蘭已是世界上最瀕危的植物物種之一，所有野生種均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄I而被禁止交易。突破其種苗繁殖技術(shù)瓶頸有利于兜蘭種質(zhì)資源的保護和可持續(xù)利用。本文對兜蘭屬植物無菌播種、共生萌發(fā)和組織培養(yǎng)技術(shù)等離體快繁技術(shù)的進展進行綜述，并提出了目前存在的問題和解決方法，以期為兜蘭屬植物離體繁殖技術(shù)的深入研究和優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：兜蘭;無菌播種;共生萌發(fā);組織培養(yǎng);快速繁殖

中圖分類號：Q813.1+2? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： Paphiopedilum are one of the most endangered plant species in the world as a result of over-collection， loss of suitable habitats and difficulty of propagatation， all wild species are listed in the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora （CITES） Appendix I and their trade is prohibited. Successful propagation techniques are beneficial to germplasm resources protection and sustainable utilization. In this paper， the propagation technologies in vitro on asepsis sowing， symbiotic seed germination and tissue culture of Paphiopedilum were reviewed and the existing problems and solutions were put forward in order to provide reference for the further research on the propagation technology in vitro and the large-scale production of high-quality seedlings of the genus.

Keywords： Paphiopedilum; asepsis sowing; symbiotic seed germination; tissue culture; rapid propagation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.014

兜蘭（Paphiopedilum）由于其獨特的花朵造型、絢麗的花朵色彩、持久的觀賞花期而具有極高的觀賞價值，是國際花卉市場上十分流行的高檔花卉，在世界上有著大量的愛好者，在我國也將可能成為繼蝴蝶蘭、大花蕙蘭、石斛蘭后又一類極具市場前景的觀賞蘭花，市場前景十分巨大。然而，兜蘭由于其種苗繁殖難度大，栽培周期較長等原因，遠(yuǎn)不能滿足市場的需求，從而導(dǎo)致其野生資源被過度采挖，同時，由于其生存環(huán)境的惡化，兜蘭已成為世界上最瀕危的植物物種之一，所有野生種類均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄I而被禁止交易。要進行兜蘭種質(zhì)資源的有效保護和可持續(xù)利用，突破其繁殖技術(shù)瓶頸是關(guān)鍵[1]。

兜蘭的傳統(tǒng)繁殖方法常采用分株繁殖，即分割叢生的假鱗莖后獨立栽培，但繁殖系數(shù)低，繁殖速度慢，難以滿足物種保護和商品生產(chǎn)的需求。兜蘭的種子和其他蘭花種子一樣細(xì)小如塵，無胚乳，在自然生境中需要與真菌共生才可萌發(fā)。在無菌播種技術(shù)發(fā)明前已有人采用種植過兜蘭的盆土或從兜蘭原生地采集土壤，利用土壤中的共生真菌進行種子共生萌發(fā)[2];在無菌播種技術(shù)發(fā)明后，有人在營養(yǎng)培養(yǎng)基上加入從兜蘭中分離到的共生真菌促進種子萌發(fā)，但操作較為繁瑣。兜蘭的組織培養(yǎng)能保持母株優(yōu)良特性，但由于滅菌時去污染難、增殖速率慢等原因，世界上還沒有利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行種苗規(guī)模化生產(chǎn)的報道[1-2]。自1922年法國Kundson建立了非共生萌發(fā)（asymbiotic germination）技術(shù)以后，使得蘭花種子在人工培養(yǎng)基上高效萌發(fā)，從而推進了蘭花產(chǎn)業(yè)化的進程[3]，目前，無菌播種是兜蘭最有效的繁殖手段[4]。本文對兜蘭屬植物的無菌播種、共生萌發(fā)和組織培養(yǎng)進行全面綜述，并提出了目前存在的問題和解決方法，以期為兜蘭屬植物繁殖技術(shù)的深入研究和優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1? 離體繁殖的兜蘭種類和品種

迄今為止，已有大量的研究報道了兜蘭的離體快繁，涉及的材料有33個原生種和55個雜交種。其中采用無菌播種的兜蘭原生種30個，雜交種50個;采用共生萌發(fā)的有3個原生種[5-7];采用組織培養(yǎng)技術(shù)研究的有原生種6個、雜交種4個。由于種類或品種差異，文獻中報道的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件也具有較大的差異[1]。

2? 無菌播種研究進展

兜蘭是蘭科植物中無菌播種最困難的種類之一。影響兜蘭屬植物種子非共生萌發(fā)的因素主要包括種子成熟度、預(yù)處理方法、培養(yǎng)基成分（包括基本培養(yǎng)基、pH值、碳源、植物生長調(diào)節(jié)劑、有機添加物、活性炭）、培養(yǎng)方式（固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和液-固體分層培養(yǎng)等）和培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)溫度、光照）等[1]。

2.1? 種子成熟度對其萌發(fā)的影響

種子成熟度是影響兜蘭種子非共生萌發(fā)率的一個關(guān)鍵因素，已報道的兜蘭種子通常在一個合適的胚齡期萌發(fā)率最高，完全成熟的兜蘭種子常常較難萌發(fā)[8-21]。兜蘭從授粉到種子成熟，不同兜蘭所需的時間長短不同，兜蘭種子最合適的萌發(fā)時期因種類而異，如菲律賓兜蘭（P. philippinense）和古德兜蘭（P. goodefroyae）最佳萌發(fā)期為授粉后90 d，報春兜蘭（P. primulinum）為授粉后110 d，巨瓣兜蘭（P. bellatulum）為授粉后130 d，白花兜蘭（P. niveum）、海倫兜蘭（P. helenae）、亨利兜蘭（P. henryanum）、白旗兜蘭（P. spicerianum）和德氏兜蘭（P. delenatii）為授粉后150 d[8， 12]。Zeng等[15]報道彩云兜蘭（P. wardii）在授粉后180 d時萌發(fā)率最高，Zhang等[16]報道杏黃兜蘭（P. armeniacum）授粉后95 d時萌發(fā)率最高，但授粉后110 d時成苗率最高。同一種類在不同的實驗中也表現(xiàn)出差異，如陳之林等[9]報道，杏黃兜蘭和硬葉兜蘭（P. micranthum）在授粉后120 d的種子可萌發(fā)，萌發(fā)率約為32.4%和25.2%，而授粉后180 d的種子不能萌發(fā);丁長春等[10]報道，杏黃兜蘭授粉后60 d時就能萌發(fā)，萌發(fā)率約為3.5%，隨后萌發(fā)率逐步升高，授粉后120 d時達(dá)到最高40.6%，隨后逐步下降，180 d時約為22.9%。Lee[18]報道授粉后150 d的種子在1/4 MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率為68.0%，高于授粉后3個月的20%。Nhut等[19]報道，德氏兜蘭授粉后9個月的種子在Knudson C培養(yǎng)基中萌發(fā)率為90.1%，高于授粉后3個月的0%或授粉后6個月的8.8%。陳瑩等[21]報道，白旗兜蘭在授粉后270 d的種子萌發(fā)率最高，為17.72%。太過幼嫩的種子萌發(fā)率低的原因在于其種胚未發(fā)育成熟，需要更多的時間進行器官形成或進行營養(yǎng)物質(zhì)的合成以利于從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)物質(zhì)而萌發(fā)[16， 19]。成熟的種子萌發(fā)率低的原因可能是成熟的種子形成了不可滲透的種皮，阻礙了水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[17， 22]，或者在種子中出現(xiàn)了抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)如脫落酸（ABA）等，或者缺少促進種子萌發(fā)的激素如赤霉素等[23]。Lee[18]報道，德氏兜蘭種子在授粉后150 d時萌發(fā)率為68%，此時，種子角質(zhì)層尚未形成，胚柄細(xì)胞多液泡，有利于萌發(fā)時功能物質(zhì)的吸收[11];而210 d時大部分種子已形成角質(zhì)層，萌發(fā)率也僅為31%。Zhang等[16]在杏黃兜蘭的研究中得到了相似的結(jié)論，F(xiàn)ang等[22]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因表達(dá)分析結(jié)果得出，種子中非甲基化木質(zhì)素的積累和萌發(fā)率呈正相關(guān)。值得注意的是，盡管未成熟的種子具有較高的萌發(fā)率，但無論如何，太幼嫩時往往成苗率較低[15]，而成熟的種子更有利于種子保存。

2.6? 培養(yǎng)方式和pH值對種子萌發(fā)的影響

液體培養(yǎng)可以稀釋蘭花種皮中產(chǎn)生的抑制物質(zhì)而促進萌發(fā)并增加種子萌發(fā)率[48];李哖等[8]報道液體培養(yǎng)對巨瓣兜蘭、德氏兜蘭和報春兜蘭的種子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的促進作用。丁長春等[10]報道杏黃兜蘭種子在固體或液體培養(yǎng)基上的萌發(fā)率無顯著性差異，但液體培養(yǎng)能綜合種子的萌發(fā)時間并促進種子萌發(fā)的統(tǒng)一性。

在兜蘭種子萌發(fā)中，培養(yǎng)基的pH值在5.0～6.0之間。Pierik等[35]報道緣毛兜蘭（P. ciliolare）在pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0 的培養(yǎng)基上種子的萌發(fā)率沒有明顯的差異，但原球莖的進一步發(fā)育時，在兩個較高的pH值下明顯受到抑制。

2.7? 糖源和活性炭對種子萌發(fā)的影響

糖類物質(zhì)作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑，對兜蘭種子萌發(fā)和原球莖的生長影響較大，培養(yǎng)基中沒有糖源時，種子不能萌發(fā)[28， 35]。糖源的種類和濃度對兜蘭種子的影響不同。Long等[20]在培養(yǎng)基中加入20 g/L葡萄糖時，紫毛兜蘭的種子萌發(fā)率為19%，加入相同濃度的蔗糖時，種子萌發(fā)率約為9.8%，而加入麥芽糖或甘露醇時僅為2.5%和0.08%。Pierik等[35]在培養(yǎng)基中加入0.5%葡萄糖和0.5%果糖時，緣毛兜蘭種子的萌發(fā)率達(dá)到48%;在加入1%葡萄糖和1%果糖時，種子的萌發(fā)率僅為37%;在加入1.25%葡萄糖和1.25%果糖時，種子的萌發(fā)率僅為29%;在加入0.75%葡萄糖和0.75%果糖時，種子的萌發(fā)率為41%。

在培養(yǎng)基中加入活性炭對于兜蘭種子萌發(fā)的影響沒有統(tǒng)一的結(jié)論。Ernst[40-41]報道活性炭有利于兜蘭種子萌發(fā);Pierik等[35]報道，在培養(yǎng)基中加入活性炭對緣毛兜蘭種子的萌發(fā)沒有影響，但抑制其幼苗在光下的生長;李哖等[8]在培養(yǎng)基中加入活性炭對德氏兜蘭和報春兜蘭的種子萌發(fā)沒有影響，但促進巨瓣兜蘭種子的萌發(fā);丁長春等[10]在1/5MS培養(yǎng)基中加入2 g/L 活性炭時，杏黃兜蘭種子的萌發(fā)率為36.1%遠(yuǎn)高于沒有活性炭時的9.6%。在培養(yǎng)基中加入活性炭能促進種子萌發(fā)，可能是由于在培養(yǎng)基中加入活性炭提高了培養(yǎng)基的通透性、增加了一些微量元素或吸收種子萌發(fā)時產(chǎn)生的抑制物質(zhì)[40， 49]。

2.8? 光照對其萌發(fā)的影響

光照條件對種子萌發(fā)影響較大。通常認(rèn)為附生蘭需要光照，而地生蘭需要黑暗培養(yǎng)誘導(dǎo)種子發(fā)芽，但實際上，蘭花種子對光周期的反應(yīng)因種類而異，與它是附生蘭或地生蘭無關(guān)。Stimart等[42]報道，在Burgeff EG-1、Thomale GD、KC和Norstog四種培養(yǎng)基中，Burgeff EG-1適合于兜蘭種子在光下的萌發(fā)和隨后的幼苗生長;Thomale GD適合于兜蘭種子在黑暗下的萌發(fā)和隨后的幼苗生長。Tay等[38]報道蘇氏兜蘭和其雜交種在Norstog培養(yǎng)中于黑暗條件下培養(yǎng)6周或更長時間有利于種子萌發(fā)和原球莖的發(fā)育，在此培養(yǎng)基上，在光下培養(yǎng)，大部分原球莖或變褐或死亡;然而幼苗在Burgeff EG-1培養(yǎng)基上在光照條件下最適合于它的生長。Zeng等[15]報道先黑暗培養(yǎng)30～ 45 d再在每天16 h光照培養(yǎng)，比全黑暗培養(yǎng)或僅在16 h光照培養(yǎng)時，萌發(fā)率顯著提高。Norstog培養(yǎng)基中的氨基酸促進兜蘭種子的萌發(fā)和原球莖的生長，但抑制其他一些蘭花如杓蘭（Cypri pedium reginae）幼苗的形成[50]。在Norstog培養(yǎng)基中光抑制的產(chǎn)生可能是在光下氨基酸的利用受到抑制。Pierik等[35]報道，緣毛兜蘭在0～ 3.0 W/m2的光密度下，隨著光照的增強，萌發(fā)率逐步降低，但光照有利于植株的生長。陳之林等[9]報道杏黃兜蘭和硬葉兜蘭經(jīng)歷3周的暗培養(yǎng)有利于提高其種子萌發(fā)率。

3? 組織培養(yǎng)研究進展

3.1? 外植體的選擇

用于蘭花離體培養(yǎng)的外植體種類很多，除常見的莖尖、葉片和種子外，還有花梗、花梗腋芽、側(cè)芽、花芽、莖段、根尖等[51]，同時還有人使用PLB薄切片作為外植體[52-53]。總體說來，利用莖尖作為外植體在多種蘭花的組織培養(yǎng)中獲得成功的實例多，技術(shù)也較為成熟，最先利用這一繁殖方法的是法國人Morel，他通過莖尖培養(yǎng)獲得類原球莖（PLB），培養(yǎng)了無病毒的大花蕙蘭植株并實現(xiàn)了快速繁殖，從而創(chuàng)造了蘭花工業(yè)[54]。但是使用莖尖為外植體時，對母體傷害較大，且莖尖的來源比較有限。

在兜蘭的組織培養(yǎng)中，試管苗常被用作外植體，已有采用無菌播種所獲得試管苗的莖尖[55-56]、莖節(jié)[56-58]、類原球莖[59-60]或葉片[59， 61]等。Huang等[55]利用P. philippinense × P. Susan Booth雜交種兜蘭種子無菌播種的無菌苗的莖尖為外植體進行叢生芽的誘導(dǎo)和直接成苗。Chen等[61-62]利用菲律賓兜蘭（P. philippinense）的雜交種PH59、PH60的莖節(jié)、葉片為外植體誘導(dǎo)出了不定芽和帶根的小植株;Lin等[59]利用試管苗的葉片誘導(dǎo)出了愈傷組織并成苗。

在采用試管外兜蘭材料組織培養(yǎng)的外植體利用方面，由于外植體的去污難度大（如采用莖尖做外植體時，即便是種植在溫室中的兜蘭，通過常規(guī)消毒仍大量地被細(xì)菌、真菌、病毒和其他病原菌感染）或由于外植體誘導(dǎo)的效率較低而較少報道[1， 63-65]。1975年Stewart等[63]分別利用室外3個兜蘭品種的年幼花莖、成熟花莖、葉尖、根尖、雄蕊、子房和頂芽誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有頂芽能產(chǎn)生愈傷組織。在頂芽培養(yǎng)中，126個外植體，僅29個沒被污染。且頂芽形成的愈傷組織數(shù)量很少，在繼代培養(yǎng)的過程中，也僅有少量愈傷組織沒有分化成苗。Huang等[55]通過采用2～ 3 mm的莖尖生長點為外植體時，能有效提高消毒的成功率，但由于外植體過小，外植體的啟動生長的速度慢，也易死亡。楊燕萍等[64]在常規(guī)消毒亨利兜蘭莖尖后，發(fā)現(xiàn)用0.1%克拉霉素浸泡5 min能較有效地減少內(nèi)生菌的污染率。Liao等[66]利用兜蘭雜交種P. Deperle和P. Armeni White的花莖橫切片誘導(dǎo)出了不定芽，并再生了完整植株。

3.2? 基本培養(yǎng)基

目前應(yīng)用于兜蘭組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)基有Heller [63-64]、MS[19， 57， 65]、改良的MS[61-62， 66]和1/2MS[56， 58-59， 67]等。

3.3? 植株再生的方式

進行兜蘭組織培養(yǎng)時，主要有愈傷組織或類原球莖誘導(dǎo)再生途徑和叢生芽再生途徑兩種方式[1]，Lin等[59]采用兜蘭雜交種P. callosum ‘Oakhi×P. lawrenceanum ‘Tradition種子萌發(fā)而來的原球莖在1/2MS添加1～10 mg/L 2，4-D和0.1～1 mg/L TDZ上能形成愈傷組織，單獨使用TDZ未能誘導(dǎo)出愈傷組織，單獨使用2，4-D時誘導(dǎo)率低。愈傷組織在1/2MS附加5 mg/L 2，4-D和1 mg/L TDZ能增殖。增長倍率可達(dá)2.24。愈傷組織在1/2MS附加0.1 mg/L NAA和0.5 mg/L TDZ上能形成類原球莖，分化出再生芽，形成完整株。

目前兜蘭中通過愈傷組織途徑再生組培苗的文獻報道較少[20， 58-60， 62-63， 67-68]。有文獻報道兜蘭從愈傷組織轉(zhuǎn)變成PLB后，PLB直接轉(zhuǎn)變成不定芽，并沒有在PLB階段進行再次增殖[20， 59， 62， 67]。也有文獻報道愈傷組織轉(zhuǎn)變成PLB后，通過PLB增殖再次擴繁以獲得更多的組培苗[58， 60， 68]。Ng等[58]利用若氏兜蘭（P. rothschildianum）無菌播種苗的莖節(jié)為外植體通過類原球莖的誘導(dǎo)獲得了再生植株。Zeng等[60]利用漢氏兜蘭的原球莖進行了愈傷組織增殖和類原球莖誘導(dǎo)和繼代增殖，獲得了較高的繁殖系數(shù)。

兜蘭在組織培養(yǎng)過程中，可以通過不定芽增殖進行快速繁殖。一些兜蘭采用莖尖或莖節(jié)培養(yǎng)能直接誘導(dǎo)不定芽并生根成苗[56， 58， 61， 65]。Huang等[65]報道100 mg/L BA可以促進兜蘭雜交種（P. philippinense × P. Susan Booth）側(cè)芽的產(chǎn)生，而100 mg/L BA對大多數(shù)植物是有毒性的。Huang等[55]報道，在3種兜蘭雜交種（P. philippinense × P. Susan Booth; P. bellatulum ‘Big spot × P. Jo Anns Wine; P. micranthum × P. glaucophyllum）不定芽增殖和生根同時進行的研究中，BA比TDZ更加有效。陳寶玲等[69]報道叢生芽在1/2MS附加3.0 mg/L 2，4-D 和0.1 mg/L TDZ上增殖效果好，培養(yǎng)90 d時增殖倍數(shù)可達(dá)2.2。Hong等[67]報道P. Alma Gavaert單個不定芽60 d最多能誘導(dǎo)出3個新的不定芽。楊燕萍等[64]報道，以莖尖為外植體時，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以Heller+6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+AC 0.5 g/L最佳，繼代培養(yǎng)中，1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 2 mg/L+10%椰子汁+ AC 2 g/L的效果較好，叢生芽增殖倍數(shù)為3.50。壯苗生根以1/2MS+NAA 1.0 mg/L+10%土豆汁+ AC 2 g/L為好。Long等[20]以播種獲得的3～ 4 cm高的小苗或其莖節(jié)為材料，同一材料在不同的細(xì)胞分裂素和生長素的組合條件下除了新芽數(shù)目不一樣以外，新芽的長度也存在顯著差異;不同的材料對細(xì)胞分裂素和生長素的敏感性不一樣，BA達(dá)到4 mg/L時，波瓣兜蘭的芽褐化，杏黃兜蘭莖節(jié)的新芽最多、最長。Nhut等[57]報道單個莖節(jié)再生成不定芽的百分率最高為75%。Luan等[68]在室外調(diào)節(jié)光源使得莖長長后，取莖節(jié)無菌消毒，污染率為37.50%～52.50%，不定芽再生率最高為33.50%。此外，有2篇文獻報道通過破壞不定芽的生長點（莖尖），可促進不定芽的增殖[19， 70]。

3.4? 植物生長調(diào)節(jié)劑對成苗的影響

目前常使用的外源激素主要是生長素（2，4-D和NAA等）和細(xì)胞分裂素類（BA、ZT和KT等）。Nhut等[57]在進行德氏兜蘭莖節(jié)培養(yǎng)時，BA濃度為2.0 mg/L時，具有最高的不定芽形成率（54.5%），且芽較小，而使用1.5 mg/L的Zeatin或TDZ時，芽較大，誘導(dǎo)率分別是58.3%和75%。Ng等[58]利用若氏兜蘭無菌播種苗的莖節(jié)為外植體，在1/2MS培養(yǎng)基上以不同濃度的BA和KT進行類原球莖的誘導(dǎo)時，4.0 ?mol/L KT的誘導(dǎo)效果最好，每個外植體在培養(yǎng)8周后能形成4.1個類原球莖（PLBs）。Chen等[62]報道，2，4-D對兜蘭莖節(jié)不定芽的誘導(dǎo)有一定的促進作用，其濃度以1.0 mg/L效果較好。在菲律賓兜蘭（P. philippinense）的2個雜交種——PH59和PH60中，PH59在1/2MS培養(yǎng)基上附加1.0 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L TDZ組合時效果比單獨使用1.0 mg/L 2，4-D或0.1 mg/L TDZ時好。在無激素的1/2MS培養(yǎng)基上，PH59有33.3%形成了芽，而PH60無不定芽的生成。雜種PH60在使用0.1 mg/L TDZ時能獲得較高的不定芽誘導(dǎo)率。Huang等[55]報道，利用3個兜蘭的雜交種試管苗的莖尖為外植體時，在MS培養(yǎng)基附加3.0 mg/L BA、0.3 mg/L NAA、60 g/L硫酸腺嘌呤、1700 mg/L磷酸二氫鈉和15%的椰子汁時能較好地一次成苗。在BA的濃度分別為3、9、27、100 mg/L時，BA濃度對不定芽的誘導(dǎo)和生根的影響不大，但高濃度時對根的誘導(dǎo)表現(xiàn)出抑制作用。TDZ濃度（0.003、0.03、0.3 mg/L）在初代培養(yǎng)時對不定芽的增殖和生根沒有明顯影響，但繼代培養(yǎng)時則對不定芽誘導(dǎo)表現(xiàn)出抑制作用，且濃度越高，抑制作用越強;除在第3代時低濃度（0.003 mg/L）的TDZ可明顯促進生根外，TDZ多表現(xiàn)為抑制生根，濃度越高，抑制作用越強。NAA對不定芽的生長影響不大，但在較高濃度（超過1.0 mg/L）時對不定芽的生成有輕微的抑制作用。對根的誘導(dǎo)在較高濃度（0.3 mg/L和1.0 mg/L）時比較低濃度（0.03 mg/L）的效果好。Chen等[61]分別采用未切割的1.5 cm完整葉和0.5 cm的葉片切塊作為葉片外植體，完整葉片和葉片切塊的不定芽誘導(dǎo)率、出芽個數(shù)與葉片的培養(yǎng)方式、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度及兜蘭品種有關(guān)，其中植物生長調(diào)節(jié)劑多表現(xiàn)出抑制作用。葉片未切割時，在1/2MS培養(yǎng)基上PH59、PH60均有25%的外植體分化出芽，添加植物生長調(diào)節(jié)劑時，1.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L TDZ能促進PH59不定芽的形成，1.0 mg/L 2，4-D、5.0 mg/L TDZ、1.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L TDZ能促進PH60不定芽的生成。切割葉片時，PH60只在1/2MS+ 1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L TDZ誘導(dǎo)出了叢生芽，而其他所有植物生長調(diào)節(jié)劑及其組合均表現(xiàn)出一定的抑制作用;而PH59在1.0 mg/L TDZ時盡管出芽的葉片數(shù)減少，但每個葉片的平均出芽數(shù)增多，可達(dá)7.0個，而對照為5.6個。Hong等[67]報道，摩帝類兜蘭（Paphiopedilum Alma Gavaert）的種子在1/2MS培養(yǎng)基附加6.0 mg/L 2，4-D+ 1.0 mg/L TDZ時，在黑暗培養(yǎng)中誘導(dǎo)有分化能力的愈傷組織，愈傷組織在1/2MS培養(yǎng)基附加6.0 mg/L NAA時能形成類原球莖，繼而分化成芽并形成小植株;而1/2MS培養(yǎng)基附加1.0 mg/L KT時有利于叢生芽的增殖。Nhut等[19]報道采用損傷和液體培養(yǎng)的方法，德氏兜蘭幼苗在MS培養(yǎng)基補充1.0 mg/L TDZ時，每個損傷的葉片能形成5個叢生芽。

3.5? 糖源對成苗的影響

糖類物質(zhì)作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑，對原球莖的生長影響較大，不同種類的糖源及其濃度對蘭花組培的作用不同。在兜蘭的組織培養(yǎng)中，蔗糖的效果比麥芽糖好，濃度以30 g/L的效果最好[55]。

3.6? 有機添加物對成苗的影響

Huang等[55]報道在有機添加物中，15%（V/V）的椰子汁和1.0 g/L的水解酪蛋白能最好地促進不定芽的誘導(dǎo)和不定根的形成;但10 g/L的土豆汁能促進不定芽的生長，對不定根的誘導(dǎo)影響不大;香蕉汁能促進不定芽的形成，20 g/L的效果最好，但對生根起抑制作用，特別是在高濃度（40 g/L和60 mg/L）時非常明顯。Ng等[58]報道在1/2MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的香蕉汁、椰子汁、土豆汁和番茄汁時，20%的椰子汁最有利于類原球莖分化成植株。

4? 共生萌發(fā)研究進展

大部分蘭科植物的種子非常微小，無胚乳，呈粉塵狀，在自然狀態(tài)下需要和真菌共生才能萌發(fā)。在植物無菌播種和組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)明之前，蘭科植物的有性繁殖常采用在原生地的土壤中播種進行繁殖或采取帶有蘭科植物原生地共生真菌的土壤在實驗室進行播種繁殖[71-74]。共生真菌在蘭科植物的種子萌發(fā)中起到了關(guān)鍵作用，根據(jù)目前已有的研究結(jié)果，促進蘭花種子萌發(fā)的真菌具有專一性[7]。Khamchatra等[5]報道從紫毛兜蘭根中分離得到真菌PVCP01（Tulasnella sp.）能促進其種子萌發(fā)和隨后各階段的生長，而PVCP05（Ceratobasidium sp.）和PVCP06（Flavodon sp.）僅能促進種子萌發(fā)及發(fā)育到第二期。在離體培養(yǎng)成苗時，共生真菌也具有宿主專一性，如朱鑫敏等[75]等從硬葉兜蘭和杏黃兜蘭根中分別分離得到瘤菌根菌屬（Epulorhiza）真菌PM-1和美孢膠膜菌（Tulasnella calospora）PA-1。在營養(yǎng)相對貧瘠的DE培養(yǎng)基上，PM-1和PA-1分別與硬葉兜蘭和杏黃兜蘭共培養(yǎng)時，PM-1能促進2種兜蘭生長;PA-1對2種兜蘭生長的影響不顯著，但真菌對宿主植物生長的促進作用更強。PM-1和PA-1在營養(yǎng)豐富的Harvais培養(yǎng)基上與硬葉兜蘭和杏黃兜蘭共培養(yǎng)時不利于共生。

為了獲得蘭科植物種子萌發(fā)階段的共生真菌，Rasmussen等[76]發(fā)明了蘭科植物種子原地共生萌發(fā)技術(shù)（in situ seed baiting technique），他們將蘭花種子裝入能透過水和微生物但不能透出種子的尼龍膜制成的袋子中，埋于蘭科植物原生境，一段時間后，能從萌發(fā)的原球莖或小幼苗中分離得到共生真菌。在國際上，該項技術(shù)已成為蘭科菌根真菌研究及蘭花保育中的一項常用技術(shù)，并通過該技術(shù)獲得了一系列能促進蘭科種子萌發(fā)的共生真菌[77]。有關(guān)促進兜蘭種子萌發(fā)的共生真菌研究較少，孫曉穎等[6]采用原地共生萌發(fā)技術(shù)從2株自然萌發(fā)的帶葉兜蘭小幼苗中，分離和篩選出了能促進種子萌發(fā)的共生真菌——瘤菌根菌（Epulorhiza sp.），利用該共生菌與帶葉兜蘭種子在滅菌后的原生境基質(zhì)上進行室內(nèi)共生萌發(fā)試驗時發(fā)現(xiàn)，接菌的種子平均萌發(fā)率為58.35%，而對照組沒有種子萌發(fā)。Yang等[7]利用原生地的土壤作萌發(fā)基質(zhì)，在實驗室利用非原地共生萌發(fā)技術(shù)（ex situ seed baiting technique），從白旗兜蘭中分離到能促進種子萌發(fā)的2株膠膜菌科（Tulasnellaceae）共生真菌GYBQ01和GYBQ02，利用這2株真菌和白旗兜蘭進行共生培養(yǎng)時，萌發(fā)率分別為34.9%和50.8%，而對照及采用從竹葉蘭中分離的共生菌則不能促進白旗兜蘭的種子萌發(fā)。

5? 試管苗的移栽研究進展

兜蘭在出瓶前一般要在栽培溫室中煉苗2周，移栽后需保持較高的空氣濕度[9]。栽培基質(zhì)多采用火山石、樹皮、泥炭土、泥炭蘚等及其混合基質(zhì)[1]。陳寶玲等[78]使用腐熟過的碎樹皮做基質(zhì)時，帶葉兜蘭試管苗移栽成活率均達(dá)99.7%以上。紫毛兜蘭在泥炭蘚基質(zhì)中成活率為60%[20]，Ng等[56]報道國王兜蘭移栽至泥炭蘚基質(zhì)中，成活率為90%;Chen等[61-62]利用泥炭蘚做基質(zhì)，菲律賓兜蘭雜交種的試管苗成活率可達(dá)100%。陳之林等[9]報道硬葉兜蘭和杏黃兜蘭在植金石和火山石的混合基質(zhì)中移栽成活率可達(dá)70%以上;帶葉兜蘭在樹皮和火山石的混合基質(zhì)中，成活率可達(dá)75%以上[79];Zeng等[15， 66]報道采用植金石、泥炭土和樹皮（體積比2∶1∶1）時，彩云兜蘭的移栽成活率可達(dá)95%，漢氏兜蘭可達(dá)88.5%。Zhang等[16]報道杏黃兜蘭試管苗在泥炭蘚作為基質(zhì)時移栽成活率最高，達(dá)90.7%;植金石為89.3%，泥炭土為79.0%，蘭石為73.0%，植金石、泥炭土和樹皮混合基質(zhì)（體積比2∶1∶1）為86.0%，蘭石、泥炭土和樹皮混合基質(zhì)（體積比2∶1∶1）為79.3%，植金石、椰殼和樹皮混合基質(zhì)（體積比2∶1∶1）為85%。

6? 問題與展望

盡管已有大量兜蘭離體繁殖技術(shù)研究的報道，但主要集中在原生種的無菌播種以及以試管內(nèi)由種子萌發(fā)而來的原球莖或小苗進行組織培養(yǎng)，而以溫室內(nèi)材料為外植體進行組織培養(yǎng)和共生萌發(fā)的研究較少。兜蘭原生種無菌播種技術(shù)的成功，能繁殖大量的試管苗用于遷地保護和自然回歸且滿足原生種市場的需要。無論如何，共生真菌是影響蘭科植物種子萌發(fā)、地理分布和生存的主要因素，回歸到自然界的兜蘭如果采用共生萌發(fā)技術(shù)獲得，或在無菌萌發(fā)成苗后再進行共生菌的接種形成菌根會有利于回歸到自然界的蘭花的生存和世代更新，但目前對蘭科植物在萌發(fā)和生長階段是否存在專一性沒有定論，其共生的機制也不完全清楚，通過蘭科植物種子原地共生萌發(fā)技術(shù)有助于了解有益真菌的分布以及自然界中真菌與蘭科植物的專一性。

兜蘭雜交種能豐富原生種的花型花色，特別是具有較強的抗逆性。目前，兜蘭新品種主要通過雜交獲得，但兜蘭的遠(yuǎn)緣雜交成功率低，一些兜蘭種類不成熟種子萌發(fā)后也常常存在生長停滯后死亡的現(xiàn)象，通過組織培養(yǎng)等生物技術(shù)進行早期幼胚培養(yǎng)能在一定程度上解決這個問題，但生長停滯的機制尚不清楚，值得深入研究;同時，在試管苗內(nèi)通過物理或化學(xué)誘變方法也能進行兜蘭新品種培育[68]，特別是試管開花技術(shù)的使用能使蘭科植物在幼年期開花從而加速育種的進程[43]。

雜交種通過播種繁殖時，其后代性狀不一致，特別是摩帝類兜蘭花期完全不一致，嚴(yán)重地制約了它的產(chǎn)業(yè)化推廣。采用兜蘭優(yōu)良株系的營養(yǎng)器官為外植體進行組織培養(yǎng)時，存在外植體去污染難、增殖系數(shù)低、生產(chǎn)速度慢等問題。中國科學(xué)院華南植物園科研團隊對兜蘭組織培養(yǎng)技術(shù)進行了長期研究，通過在溫室中先噴施殺菌劑培養(yǎng)一段時間，能較有效地抑制內(nèi)生菌從而減少外植體的接種污染率，通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，已能以溫室中優(yōu)良摩帝類兜蘭的側(cè)芽為外植體，進行種苗的規(guī)?；a(chǎn)，獲得成功的品系已有10多個，相關(guān)成果已在中國和日本獲得了專利保護權(quán)，目前正在熟化相關(guān)技術(shù)進行種苗的規(guī)?；a(chǎn)，已獲得了遺傳背景一致的優(yōu)質(zhì)雜交兜蘭種苗，利用這些種苗能進行有效的花期調(diào)控研究，使其應(yīng)節(jié)開花，能提高產(chǎn)品的附加值。但大部分種類的組織培養(yǎng)增殖速度較慢，難以進行商品化生產(chǎn)，影響其繁殖速度的遺傳機制尚不清楚，需要進行深入研究，只有大部分優(yōu)良兜蘭品種能利用組織培養(yǎng)進行規(guī)模化生產(chǎn)時，兜蘭產(chǎn)業(yè)才能進入快速發(fā)展的軌道。

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