衡燕芳，李健，王崢，陳卓，何航，鄧興旺，馬力耕

十倍體長穗偃麥草雄性育性基因的克隆、表達(dá)及功能分析

衡燕芳1，李健2，王崢2，陳卓1，何航2，鄧興旺2，馬力耕1

（1首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，山東濰坊 261325）

【】從小麥隱性核雄性不育突變體與十倍體長穗偃麥草異附加系中，克隆雄性育性恢復(fù)基因，解析該基因的表達(dá)模式、編碼蛋白的生物化學(xué)活性和生物學(xué)功能，鑒定新的小麥育性恢復(fù)基因，從而更好地應(yīng)用于小麥雜交育種。通過基因組原位雜交（genomichybridization，GISH），鑒定與十倍體長穗偃麥草異附加系中小麥外源的染色體類型；通過同源克隆法在小麥-十倍體長穗偃麥草異附加系中克隆雄性育性基因，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化小麥進(jìn)行基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證；利用RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析檢測基因的表達(dá)模式；進(jìn)一步通過RNA原位雜交分析基因的組織細(xì)胞特異性表達(dá)特性；利用特異性抗體進(jìn)行Western blot檢測ThMs1蛋白在體內(nèi)的表達(dá)情況；經(jīng)SignalP軟件分析預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)；通過蛋白-脂質(zhì)結(jié)合活性分析檢測ThMs1蛋白是否具有脂類分子結(jié)合活性。證實(shí)小麥與十倍體長穗偃麥草異附加系細(xì)胞中含有偃麥草4Ag染色體；從小麥-十倍體長穗偃麥草異附加系中克隆了雄性育性基因，遺傳轉(zhuǎn)化功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)能夠完全恢復(fù)小麥突變體的雄性不育表型，基因的聚類分析表明只存在于禾本科植物中；通過RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)在減數(shù)分裂期的花藥中特異表達(dá)，RNA原位雜交分析證實(shí)在小麥小孢子發(fā)生過程中特異表達(dá)；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)ThMs1在小麥減數(shù)分裂期的花藥中表達(dá)；對(duì)ThMs1蛋白氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有推測的脂類結(jié)合分子結(jié)構(gòu)域，ThMs1蛋白脂類分子結(jié)合試驗(yàn)表明ThMs1蛋白特異結(jié)合磷脂酸和磷酸化的磷脂酰肌醇?？寺×艘粋€(gè)新的來自十倍體長穗偃麥草、可恢復(fù)小麥隱性核雄性不育突變體雄性育性的，該基因與小麥具有相似的分子結(jié)構(gòu)、時(shí)空表達(dá)模式和脂結(jié)合活性，導(dǎo)致2個(gè)蛋白在小麥中也具有相似的生物學(xué)功能，可以替代普通小麥的功能調(diào)控小麥花粉育性，該結(jié)果為利用小麥通過分子設(shè)計(jì)建立小麥雜交育種體系（新一代雜交育種體系）提供了一個(gè)新的育性恢復(fù)基因。

普通小麥；小麥-十倍體長穗偃麥草異附加系；隱性核雄性不育；；；小麥雜交育種體系；分子設(shè)計(jì)育種

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)侨蚍秶鷥?nèi)廣泛種植的農(nóng)作物，世界上約30%的人口以小麥為主食。隨著全球人口的不斷增加和耕地面積的不斷減少，為了確保未來的全球糧食安全，急需將新一代雜交育種技術(shù)（分子設(shè)計(jì)雜交育種技術(shù)）引入小麥育種，利用雜種優(yōu)勢培育產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、抗性好的新品種來滿足全球人口對(duì)糧食的需求[1-5]。小麥?zhǔn)堑湫偷淖曰ㄊ诜圩魑?，?shí)現(xiàn)新一代雜交育種的關(guān)鍵是篩選雄性不育突變體并克隆相關(guān)育性調(diào)控基因。十倍體長穗偃麥草具有抗病、抗寒、抗旱、耐貧瘠、長穗多花等多種優(yōu)異性狀[6-8]，是小麥遺傳改良中重要的野生近緣種質(zhì)資源之一，克隆和利用偃麥草中的雄性育性調(diào)控基因，可以為遠(yuǎn)緣雜交育種提供基因資源及理論支撐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】小麥雄性不育突變體篩選工作始于60年前，目前，人們在普通小麥中發(fā)現(xiàn)至少5個(gè)核基因突變導(dǎo)致的雄性不育突變體，它們被命名為—[9-10]，其中，和是隱性突變體，、和是顯性突變體。在水稻中的研究結(jié)果表明，克隆導(dǎo)致小麥雄性不育的基因是了解小麥雄性育性調(diào)控機(jī)制和建立新一代雜交育種體系的關(guān)鍵[4-5]。中國2個(gè)團(tuán)隊(duì)分別克隆和鑒定了小麥[11-12]，發(fā)現(xiàn)普通小麥中是不表達(dá)的，在突變體中，由于啟動(dòng)子區(qū)插入一個(gè)轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致在花藥中表達(dá)，最終引起花粉母細(xì)胞和絨氈層降解導(dǎo)致雄性不育。國內(nèi)馬力耕和鄧興旺課題組與國外研究人員同時(shí)報(bào)道了小麥的克隆，發(fā)現(xiàn)特異存在于禾本科植物中，在小孢子母細(xì)胞特異表達(dá)，該基因突變導(dǎo)致雄配子發(fā)生障礙[13-14]。最近，也被克隆[15]，其在小麥中有2個(gè)等位基因同時(shí)不同程度地發(fā)揮功能。小麥隱性雄性不育突變體基因的克隆和分子鑒定對(duì)了解小麥雄性育性調(diào)控機(jī)制極為關(guān)鍵，同時(shí)這些突變體以及育性基因也為分子設(shè)計(jì)雜交育種提供了寶貴的小麥基因資源和受體材料?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】小麥核雄性不育突變體穩(wěn)定的不育特性及其隱性特征使得適合用于小麥分子設(shè)計(jì)雜交育種實(shí)踐中，發(fā)掘雄性不育突變體的育性恢復(fù)基因是實(shí)現(xiàn)雜交育種的另一個(gè)關(guān)鍵因素。篩選鑒定除以外的新的育性恢復(fù)基因會(huì)為分子設(shè)計(jì)育種提供更多的選擇。李振聲先生等培育的“藍(lán)粒小麥”攜帶了4Ag染色體，其著絲點(diǎn)及近著絲點(diǎn)區(qū)來自于十倍體長穗偃麥草的E基因組（EeEbEx），而染色體兩臂的端部區(qū)域來自于St基因組，是一條重組染色體[16]。筆者此前以小麥雄性不育突變體為母本，以“藍(lán)粒小麥”為父本，從雜交后代中篩選出雄性育性得以恢復(fù)的異附加系材料，表明該重組染色體上含有恢復(fù)育性的基因。本文以此異附加系為材料，通過同源克隆的方法獲得來自十倍體長穗偃麥草、可恢復(fù)小麥隱性核雄性不育突變體雄性育性的，該工作的結(jié)果既可用于小麥雜交育種，又為利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)發(fā)掘近緣種中的有利遺傳資源提供了一種模式[17-20]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以小麥隱性核雄性不育突變體與十倍體長穗偃麥草異附加系為材料，克隆調(diào)控小麥雄性育性的，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證，進(jìn)一步的基因表達(dá)分析及蛋白功能研究解析ThMs1和Ms1的關(guān)系，為該基因在小麥分子設(shè)計(jì)雜交育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通小麥（L.，2n=6x=42，AABBDD）、雄性不育突變體小麥（L.，2n=6x=42，AABBDD）、小麥-十倍體長穗偃麥草異附加系、十倍體長穗偃麥草（，2n=10x=70，StStEeEbEx）。小麥-十倍體長穗偃麥草異附加系是以小麥隱性核雄性不育突變體為母本、以李振聲先生等培育的“藍(lán)粒小麥”為父本[7,16]，在其雜交后代中選育出的穩(wěn)定雄性可育株系。十倍體長穗偃麥草由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所張學(xué)勇研究員提供。

1.2 基因組原位雜交

基因組原位雜交流程參考Zhao等[20]方法。使用Dig Translation Mix（Roche）試劑盒標(biāo)記十倍體長穗偃麥草基因組DNA探針?；蚪M原位雜交中探針與封阻DNA的比例為1﹕300，利用anti-digoxigenin- rhodamine（Roche）試劑盒檢測雜交信號(hào)。雜交后染色體用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑（Vector Laboratories）進(jìn)行復(fù)染。用熒光顯微鏡（Zeiss Axio Imager M2）拍照保存。

1.3 基因克隆、RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRI試劑（Takara Bio Inc.）提取材料減數(shù)分裂期花藥的RNA，并用DNaseⅠ（Promega）去除基因組DNA污染。通過First-Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher）合成cDNA。以cDNA為模板，基于小麥及其他物種已知序列設(shè)計(jì)引物（電子附表1）從小麥-十倍體長穗偃麥草中擴(kuò)增。利用LA Taq（Takara Bio Inc.）進(jìn)行RT-PCR，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)靶向基因的特異性引物，利用SYBR Premix Ex（Takara Bio Inc.），經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測表達(dá)特征。用于表達(dá)分析的引物見電子附表1。

附表1 本研究所用引物

Table S1 The primers used in this study

引物 Primer序列 Sequence (5'→3')目的 Intention ThMs1-FAGATCCCGGCGCCTGCTGCTCThMs1擴(kuò)增引物PCR primer of ThMs1 ThMs1-RCGCAGGAGCTGTAGAGCGTGAGGA BFTAGCCATCTTTGATCAATGAGC4Ag染色體鑒定analysis of 4Ag chromosome BRTGATGAAAGAGCTAGGTGATAGTTG TF1CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC轉(zhuǎn)基因鑒定analysis of transgenic lines TR1TACAATGGCTAGTAGAGATTTC TF2ATACGTTTCCTGCTACAGATTTGAGG TR2AAGCAGTGCCGCCAGAGGATCAACGC TF3TTTGCGTTCTGCTGATGATGTG TR3CTCAATTGTCCTTTAGACCATGTCTAAC TaACTIN-QFTTCCGTTGCCCTGAGGTCCRT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCRRT-PCR and real time PCR TaACTIN-QRTGATCTTCATGCTGCTTGGTGC Ms1-QFACATCATCCTCTGAGTCGCG Ms1-QRGACCACGCAAACACGTACG ThMs1-QFTCCCGGCGCCTGCTGCTC ThMs1-QRCGGCAGAGGCAGGGGACG Ms1-ISH-FaagcttGAGCGAGGGAGAGAGAGACCRNA原位雜交in situ hybridization Ms1-ISH-FgaattcATCACATAGCATCAGTGGTTC ThMs1-ISH-FaagcttCTAGCGAGCGAGCGAGAGG ThMs1-ISH-RgaattcCAACTGGACGGACCATGGC ThMs1-SB-F1TGAGATATACGGAGCGATTTAGSouthern雜交Southern blot ThMs1-SB-R1AGCACGGCAAGCTTTTGCTCTG His-FaattcCATCATCATCATCATCACTGActgcaMBP-His載體構(gòu)建Vector construction of MBP-His His-RgTCAGTGATGATGATGATGATGg Ms1s-His-FgagggaaggatttcagaattcCAGCCGGGGGCGCCGTGCMBP-Ms1-His載體構(gòu)建Vector construction of MBP-Ms1-His Ms1s-His-RcagtgccaagcttgcctgcagTCAGTGATGATGATGATGATGGGCCGCCTTGGACGGCG ThMs1s-His-FgagggaaggatttcagaattcGCGTTCGGGCCGCAGCMBP-ThMs1-His載體構(gòu)建Vector construction of MBP-ThMs1-His ThMs1s-His-RcagtgccaagcttgcctgcagtcaGTGATGATGATGATGATGGAAGAAGGCCGCCTTGGACG

1.4 RNA原位雜交

按照Shitsukawa等[21]方法進(jìn)行RNA原位雜交。將組織在甲醛-乙酸溶液（3.7%甲醛）中于4℃固定8 h。使用引物ThMs1-ISH-F/R和Ms1-ISH-F/R（電子附表1）擴(kuò)增探針，并將擴(kuò)增產(chǎn)物分別以正向和反向插入pEASY-T1載體（TransGen Biotech）。通過dⅢ（反義探針）和RⅠ（有義探針）消化，使載體線性化，將其用作模板以生成具有T7 RNA聚合酶的探針。把材料切成8 μm厚的部分進(jìn)行原位雜交，并在42℃雜交過夜。利用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色，鏡檢拍照保存。

1.5 Southern blot

使用改良的CTAB方法從幼葉中提取基因組DNA后，參照Zhao等[20]方法進(jìn)行雜交。使用核酸分析儀（NanoDrop 2000，Thermo Scientific）對(duì)純化的DNA進(jìn)行定量。基因組DNA（每個(gè)樣品40 μg）在37℃用dⅢ和RⅠ（New England Biolabs，USA）完全消化，然后在4℃和35 V下經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳。將分離的DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜（GE Healthcare）并通過UV交聯(lián)固定。電子附表1中列出了用于探針擴(kuò)增的引物，并用探針標(biāo)記試劑盒（Roche）標(biāo)記探針。用的特異性探針進(jìn)行雜交，同時(shí)提高雜交溫度（66℃）并進(jìn)行充分洗脫，從而提高雜交信號(hào)的特異性，然后使用試劑盒（GE Healthcare，RPN2106）進(jìn)行檢測分析。

1.6 轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證

將基因組DNA插入經(jīng)dⅢ酶切的pAHC20載體中，構(gòu)建用于功能互補(bǔ)試驗(yàn)的::載體（電子附圖1-A），包括該基因ATG上游2 271 bp、基因組序列1 878 bp和TGA下游628 bp。通過基因槍法將載體轉(zhuǎn)入-4Ag單體異附加系（純合突變體附加一條長穗偃麥草4Ag染色體）植株的幼胚，4Ag染色體在后代中存在分離，所以需要對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行4Ag染色體的鑒定，用于鑒定的引物BF/BR見電子附表1，不含有4Ag染色體的轉(zhuǎn)基因植株即為純合突變基因型背景。

在轉(zhuǎn)基因后代鑒定中，同時(shí)用TF1/TR1、TF2/TR2和TF3/TR3 3對(duì)引物（電子附表1）進(jìn)行PCR，3對(duì)引物均為PCR陽性，說明的啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和終止子都已整合到基因組中，鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株（電子附圖1-B），對(duì)檢測出的具有純合突變且不帶有4Ag染色體的轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行表型鑒定。

A：轉(zhuǎn)基因載體；B：轉(zhuǎn)基因株系的PCR鑒定

A: Transgenic vector of; B: Analysis of transgenic lines by PCR

附圖1 轉(zhuǎn)基因載體及轉(zhuǎn)基因株系鑒定

Fig. S1 The structure of transgenic vector and analysis of transgenic lines

1.7 序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用NCBI網(wǎng)站上提供的數(shù)據(jù)信息，獲取不同物種中MS1同源性序列，或通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增同源序列。上述序列利用Clustal X 2.1進(jìn)行多序列比對(duì)分析，然后利用MEGA 5.2.1軟件通過Neighbour-joining（NJ）方法比對(duì)序列構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.8 脂質(zhì)結(jié)合活性分析

利用SignalP軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測[22]，顯示ThMs1蛋白具有8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)的脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域，將去掉信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的ThMs1、Ms1與6×His融合構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)融合蛋白，引物序列見電子附表1。融合蛋白在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)并純化，PIP脂膜P-6001和P-6002購自Echelon Biosciences。參考Dowler等[23]方法進(jìn)行蛋白-脂質(zhì)結(jié)合活性檢測。

2 結(jié)果

2.1 十倍體長穗偃麥草ThMs1的克隆

小麥隱性核雄性不育突變體和普通小麥相比，植株在株型、生育期等農(nóng)藝性狀上無明顯差異，但在抽穗揚(yáng)花期突變體穗部的穎殼呈張開狀，而普通小麥的穎殼不張開完成自花授粉（圖1-A）。進(jìn)一步鏡檢發(fā)現(xiàn)，普通小麥的花藥發(fā)育正常、花粉可育，而雄性不育突變體與普通小麥相比雌蕊發(fā)育正常，早期花藥發(fā)育也無明顯差異，但到花粉成熟時(shí)花藥稍瘦小不開裂、花粉不育，后期不能正常受精結(jié)實(shí)（圖1-A—圖1-D）。通過基因組原位雜交（GISH）證實(shí)，在得到的附加系中，附加了十倍體長穗偃麥草4Ag染色體（圖1-E），而且附加該染色體后使小麥雄性育性得到完全恢復(fù)（圖1-A—圖1-D)。

花藥的組織切片觀察顯示，在小麥突變體中，花藥不同發(fā)育時(shí)期的藥室壁層結(jié)構(gòu)與普通小麥相比無明顯差異，絨氈層細(xì)胞的發(fā)生和降解過程與普通小麥相比也無明顯差異，但突變體小孢子發(fā)育不正常（電子附圖2）。在整個(gè)花藥及花粉發(fā)育過程中，小麥-4Ag異附加系與普通小麥相比無顯著差異（電子附圖2），表明突變沒有影響小麥孢子體組織的發(fā)育，但影響了小孢子的發(fā)育。對(duì)小孢子細(xì)胞核染色分析，發(fā)現(xiàn)突變體在小孢子發(fā)育的單核早期之前與普通小麥相比無明顯異常，到單核晚期出現(xiàn)約28%的花粉皺縮現(xiàn)象，而且細(xì)胞核也呈凝聚狀，到雙核早期表型加劇，在突變體中處于雙核晚期及三核期的花粉發(fā)育完全異常、花粉嚴(yán)重皺縮、細(xì)胞核降解，不能產(chǎn)生可育的三核成熟花粉（圖1-F）；小麥-4Ag異附加系中花藥和花粉發(fā)育與普通小麥相比無明顯差異（圖1-F），表明長穗偃麥草的附加系中含有小麥育性恢復(fù)基因。

E：表皮層；Ar：孢原細(xì)胞；Sp：造孢細(xì)胞；En：內(nèi)皮層；ML：中間層；T：絨氈層；MMC：小孢子母細(xì)胞；MC：減數(shù)分裂細(xì)胞；Tds：四分體；BP：雙核期花粉；MP：三核期花粉。標(biāo)尺=50 μm

E: epidermis; Ar: archesporial cell; Sp: sporogenous cell; En: endothecium; ML: middle layer; T: tapetum; MMC: microspore mother cell; MC: meiotic cell; Tds: tetrads; BP: bicellular pollen; MP: mature pollen. Bar=50 μm

附圖2 普通小麥、突變體、/附加系中不同 時(shí)期花藥組織石蠟切片觀察

Fig. S2 Paraffin sections of anthers from bread wheat,,/addition line at different stages

依據(jù)小麥中的序列及禾本科其他物種中的相似序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，從小麥-十倍體長穗偃麥草異附加系中，克隆了來自十倍體長穗偃麥草的雄性育性恢復(fù)基因。與小麥4A4B4D染色體上3個(gè)同源基因、和（來自小麥B基因組）的基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，顯示與小麥的這三個(gè)同源基因在基因組序列上相似性分別為88.24%、82.91%和88.94%（電子附圖3）。

附圖3及小麥同源基因序列比對(duì)分析

Fig. S3 Sequence alignment ofand its orthologues in bread wheat

為了進(jìn)一步檢測小麥-4Ag異附加系和十倍體長穗偃麥草中的拷貝數(shù)量，設(shè)計(jì)了特異的探針（序列見附圖3紅框中所示），通過Southern blot在小麥-4Ag附加系和十倍體長穗偃麥草中分別檢測到一條的特異雜交信號(hào)（圖2）；而在普通小麥和雄性不育突變體中都沒有檢測到特異的雜交信號(hào)，表明-4Ag附加系中含有一個(gè)拷貝，十倍體長穗偃麥草也含有一個(gè)拷貝（但可能還含有的同源基因）

2.2 ThMs1轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證

序列對(duì)比結(jié)果表明，是小麥的同源基因（電子附圖3）。為驗(yàn)證的功能，構(gòu)建用于功能互補(bǔ)試驗(yàn)的::載體（電子附圖1-A），并將其轉(zhuǎn)入-4Ag單體異附加系植株的幼胚所制備的愈傷組織中，獨(dú)立進(jìn)行2批轉(zhuǎn)化。通過在轉(zhuǎn)化載體上設(shè)計(jì)3對(duì)PCR引物鑒定轉(zhuǎn)基因完整性，獲得13株背景為純合基因型的T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株，后期觀察其花粉育性?？捎腡0代轉(zhuǎn)基因陽性植株自交結(jié)實(shí)得到的T1代株系繼續(xù)PCR鑒定，獲得5個(gè)獨(dú)立的、背景為純合，且不帶有4Ag染色體、轉(zhuǎn)基因可以穩(wěn)定遺傳的株系。上述轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行穗型、花藥形態(tài)和花粉育性等觀察，結(jié)果表明，在小麥中轉(zhuǎn)入能夠使突變體的花粉發(fā)育恢復(fù)正常，并正常結(jié)實(shí)（圖3），表明是小麥的同源基因，而且在小麥體內(nèi)能夠完全替代小麥的功能；同時(shí)也說明對(duì)小麥的育性表型而言，雖然小麥-4Ag異附加系轉(zhuǎn)入了一條染色體，但發(fā)揮恢復(fù)育性功能的只是一個(gè)基因。

A：開花期小麥穗，標(biāo)尺=1 cm；B：花絲伸長之后開裂的花藥，標(biāo)尺=1 mm；C：成熟花粉粒I2-KI染色，標(biāo)尺=200 μm；D：授粉后15 d的種子，標(biāo)尺=1 mm，B、C和D圖下數(shù)字表示統(tǒng)計(jì)有此表型的株數(shù)及觀察的總株數(shù)；E：基因組原位雜交分析，紅色熒光代表附加染色體；標(biāo)尺=10 μm；F：花粉DAPI染色，Bar=50 μm

基因組DNA分別用HindⅢ（A）和EcoRⅠ（B）酶切處理 Genomic DNA was digested with HindⅢ(A) and EcoRⅠ(B), respectively

普通小麥、小麥雄性不育突變體ms1g、背景為ms1g純合的T1代ThMs1轉(zhuǎn)基因陽性株系。A：開花期小麥穗，標(biāo)尺=1 cm；B：花絲伸長之后的花藥，標(biāo)尺=1 mm；C：開花后15 d的種子，標(biāo)尺=1 mm；D：成熟花粉粒I2-KI染色，標(biāo)尺=200 μm，B、C和D圖下數(shù)字表示統(tǒng)計(jì)有此表型的株數(shù)及觀察的總株數(shù)

2.3 ThMs1的表達(dá)檢測及蛋白聚類分析

基因的表達(dá)模式對(duì)其發(fā)揮功能非常關(guān)鍵，通過以下3種方式檢測在小麥-4Ag附加系中的表達(dá)模式并與小麥的表達(dá)模式比較：RT-PCR、qRT-PCR和RNA原位雜交。RT-PCR和qRT-PCR表達(dá)分析顯示和在小麥根、莖、葉中無表達(dá)，在內(nèi)外稃和雌蕊中也無表達(dá)；在發(fā)育的穗中有表達(dá)，尤其在減數(shù)分裂期的花藥中表達(dá)量較高，在單核期的花藥中有表達(dá)但表達(dá)量較低（圖4-A—圖4-D）。另外，小麥基因組中還含有的2個(gè)同源基因和，這兩個(gè)基因在所檢測的所有組織中均沒有表達(dá)，表明這兩個(gè)同源基因的表達(dá)可能被沉默了（圖4-A和圖4-B）。上述關(guān)于以及它的2個(gè)同源基因和表達(dá)模式與之前的報(bào)道一致[13]，同時(shí)也表明十倍體長穗偃麥的在4Ag附加系中與小麥中的在小麥中具有非常相似的表達(dá)模式。

附圖4 Ms1和ThMs1分別在普通小麥、4Ag附加系的減數(shù)分裂期花藥中表達(dá)檢測

Fig. S4 Analysis of expression of Ms1 and ThMs1 in developing anther during microspore meiosis from bread wheat and-4Ag addition line

進(jìn)一步通過RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)和在小孢子母細(xì)胞特異表達(dá)，兩者具有相似的表達(dá)模式，它們在花藥發(fā)育的第6期和第7期小孢子母細(xì)胞發(fā)育時(shí)表達(dá)量比較高，到花藥發(fā)育的第8期四分體時(shí)期表達(dá)量明顯下調(diào)（圖4-E和圖4-F），該表達(dá)模式與小麥的功能以及在小麥4Ag附加系中的功能一致，同時(shí)也很好地解釋了為何在小麥4Ag附加系中可以替代小麥的功能（二者有非常相似的表達(dá)模式）。

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Ms1和ThMs1蛋白分別在普通小麥和4Ag附加系的減數(shù)分裂期花藥中表達(dá)，而雄性不育突變體中沒有Ms1表達(dá)（電子附圖4）。上述結(jié)果一方面說明制備的小麥Ms1抗體能夠特異識(shí)別Ms1及其同源蛋白，同時(shí)也表明ThMs1和Ms1蛋白也有相似的表達(dá)模式。

為了解小麥和偃麥草的演化關(guān)系，將不同物種中同源序列進(jìn)行比對(duì)（電子附圖5）。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，只存在于禾本科植物中（電子附圖6）。十倍體長穗偃麥草的ThMs1蛋白與普通小麥、四倍體小麥、二倍體小麥祖先種中的MS1蛋白親緣關(guān)系較近，屬于同一分支（電子附圖6）。上述結(jié)果表明是禾本科植物進(jìn)化過程形成的一個(gè)新基因，同時(shí)也說明禾本科植物雄性育性調(diào)控可能與雙子葉植物如擬南芥以及禾本科植物以外的單子葉植物有不同之處。

Th：十倍體長穗偃麥草；Aet：節(jié)節(jié)麥；Ta：普通小麥；Tt：圓錐小麥；Tu：烏拉爾圖小麥；Bradi：二穗短柄草；Brast：短柄蘚；：大麥；：毛竹；：假稻屬；：水稻；：結(jié)縷草；：蘆葦；：淡竹葉；Sb：高粱；Si：谷子；Sevir：狗尾草；Pavir：柳枝稷。下同The same as below

附圖5 ThMs1及其同源蛋白序列的比對(duì)分析

Fig. S5 Sequence alignment of ThMs1 and its orthologues in poaceae plants

Sequences were used to produce the phylogenetic tree shown in Fig. S4

聚類分析的序列同附圖4

附圖6 ThMs1及其同源蛋白的聚類分析

Fig. S6 Phylogenetic tree of ThMs1 and its orthologs in Poaceae plants

2.4 ThMs1蛋白具有脂結(jié)合活性

ThMs1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示中間有一個(gè)具有8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)的脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域（電子附圖7）。鑒于ThMs1與Ms1同樣具有預(yù)測的脂結(jié)合（lipid transfer protein，LTP）結(jié)構(gòu)域，試圖鑒定ThMs1是否具有脂分子結(jié)合活性，并以Ms1作對(duì)照。為此，首先在大腸桿菌中表達(dá)Ms1和ThMs1蛋白，蛋白可溶性檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后能夠在細(xì)菌中表達(dá)MBP-His、MBP-Ms1-His和MBP-ThMs1-His蛋白，進(jìn)一步純化了這三種融合蛋白（圖5）。利用純化的MBP-His、MBP-Ms1-His、MBP-ThMs1-His蛋白的脂結(jié)合試驗(yàn)表明，與Ms1類似，ThMs1蛋白可以結(jié)合磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和磷酸化的磷脂酰肌醇（phosphatidylinositols，PIs），包括：磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI(3)P）、磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）、磷脂酰肌醇-5-磷酸（PI(5)P）、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸（PI(3,4)P2）、磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸（PI(3,5)P2）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI(3,4,5)P3），但不結(jié)合測試的其他脂類分子（圖5），表明Ms1和ThMs1蛋白均特異結(jié)合磷脂酸和磷酸化的磷脂酰肌醇。

A：8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)；B：預(yù)測的脂結(jié)合序列

A: The conserved domain with 8 Cysteine residues; B: Predicted lipid binding domain

附圖7 ThMs1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

Fig. S7 The predicted structures of ThMs1

3 討論

十倍體長穗偃麥草是小麥的野生近緣種，具有抗病、抗旱、長穗多花等多種優(yōu)良性狀，對(duì)小麥的遺傳改良具有重要作用[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)來自十倍體長穗偃麥草基因組中的小麥雄性育性基因的同源基因具有與小麥相似的基因結(jié)構(gòu)（電子附圖3和電子附圖7），而且在小麥中與小麥具有相似的組織細(xì)胞特異性表達(dá)模式（圖4），ThMs1和Ms1蛋白都具有脂結(jié)合活性（圖6），最終導(dǎo)致這兩個(gè)基因也具有相似的生物學(xué)功能，ThMs1可以替代Ms1的功能恢復(fù)小麥雄性不育突變體的花粉育性缺陷（圖1和圖2）。

利用雜種優(yōu)勢制備雜交種是作物遺傳育種的重要方向之一，玉米等主要農(nóng)作物已經(jīng)在雜交育種方面取得了成功并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，目前種植的玉米品種主要是通過雜交育種制備的品種[24-25]。Freeman[26]首次報(bào)道了小麥的雜種優(yōu)勢，之后研究人員也證實(shí)雜交小麥的生產(chǎn)潛力[27-28]，但由于小麥?zhǔn)亲曰ㄊ诜圩魑?，無法實(shí)現(xiàn)通過人工去雄進(jìn)行大規(guī)模雜交制種，所以利用雄性不育進(jìn)行小麥雜交制種是實(shí)現(xiàn)小麥雜種優(yōu)勢利用的最佳選擇[29-30]。過去幾十年建立的小麥雜交育種體系各有缺陷：以細(xì)胞質(zhì)雄性不育為基礎(chǔ)的第一代“三系法”系統(tǒng)，受恢保關(guān)系的制約導(dǎo)致資源利用率低[31-32]；以環(huán)境敏感型雄性不育為基礎(chǔ)的“兩系法”系統(tǒng)受光溫條件影響較大、無法滿足雜交種純度要求[28, 33-34]，導(dǎo)致目前全球雜交小麥種植面積比例很低；化學(xué)殺雄法制備雜交種，存在殺雄專一性不夠、成本高、易污染環(huán)境等缺點(diǎn)[28,35]。分子設(shè)計(jì)雜交育種技術(shù)具有不育性穩(wěn)定、控制不育性狀的基因遺傳行為簡單易于開展優(yōu)良性狀的聚合育種等優(yōu)點(diǎn)[4-5,36]。目前，利用此方法已成功實(shí)現(xiàn)了雜交水稻育種技術(shù)的新突破[4-5]。分子設(shè)計(jì)雜交育種技術(shù)也應(yīng)該適用于小麥雜交育種實(shí)踐，而實(shí)現(xiàn)小麥分子設(shè)計(jì)雜交育種技術(shù)的關(guān)鍵是篩選穩(wěn)定的小麥雄性不育突變體及對(duì)應(yīng)的育性恢復(fù)基因。本研究獲得了一個(gè)新的小麥雄性育性恢復(fù)基因，該基因在突變體中能夠完全替代小麥的功能恢復(fù)雄性育性（圖1和圖2）。因此，可以替代小麥作為育性恢復(fù)基因，應(yīng)用于利用小麥隱性核雄性不育突變體制備小麥新一代雜交育種體系中。同時(shí)，由于十倍體長穗偃麥草以及該附加系中含有植物育性以及一些抗性基因，該附加系可以應(yīng)用于小麥雜交育種體系中。為此，本文也提供了把十倍體長穗偃麥草控制重要農(nóng)藝性狀基因用于小麥育種的一種模式，即可以通過雜交把十倍體長穗偃麥草的某一條染色體導(dǎo)入小麥細(xì)胞或把某個(gè)控制重要農(nóng)藝性狀的基因轉(zhuǎn)入到小麥基因組中。

A、B：半定量PCR；C、D：實(shí)時(shí)熒光定量PCR；E、F：RNA原位雜交分析。Ms1在普通小麥中檢測，ThMs1在4Ag附加系中檢測。Sp：造孢細(xì)胞；T：絨氈層；MMC：小孢子母細(xì)胞；MC：減數(shù)分裂細(xì)胞；Tds：四分體；Le&pa：內(nèi)外稃；UM：單核期花粉；BP：雙核期花粉；MP：三核期花粉；標(biāo)尺=50 μm

A、B：MBP-His、MBP-Ms1-His、MBP-ThMs1-His蛋白的純化和檢測；MBP-His、MBP-Ms1-His、MBP-ThMs1-His蛋白覆膜：脂膜P-6001(C)和脂膜P-6002(D)。CL：心磷脂；CS：膽固醇；DAG：二酰甘油；LPA：溶血磷脂酸；LPC：溶血磷脂酰膽堿；PE：磷脂酰乙醇胺；PG：磷脂酰甘油；PI：磷脂酰肌醇；PI(3)P：磷脂酰肌醇-3-磷酸；PI(4)P：磷脂酰肌醇-4-磷酸；PI(5)P：磷脂酰肌醇-5-磷酸；PI(3,4)P2：磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸；PI(3,5)P2：磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸酯；PI(4,5)P2：磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸；PI(3,4,5)P3：磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸；PS：磷脂酰絲氨酸；SM：鞘磷脂；S1P：鞘氨醇-1-磷酸；TAG：三酰甘油

4 結(jié)論

克隆了十倍體長穗偃麥草4Ag染色體上攜帶的，偃麥草中的在小麥體內(nèi)與小麥具有相似的時(shí)空表達(dá)模式，2個(gè)蛋白也具有相似的生化活性和生物學(xué)功能。

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Cloning, Expression and Functional Analysis of a Male Fertility Gene

HENG YanFang1, LI Jian2, WANG Zheng2, CHEN Zhuo1, HE Hang2, DENG XingWang2, MA LiGeng1

(1College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048;2Peking University Institute of Advanced Agricultural Sciences, Weifang 261325, Shandong)

【】To clone a new male fertility gene,, from the-4Ag wheat-alien addition line, and characterize the expression pattern and biological function of【】4Ag chromosome fromin wheat-alien addition line was identified by GISH.was cloned from the wheat-alien addition line by homology-based cloning, and the analysis of the function of, further analyzing its tissue-specific expression by RNAhybridization. The expression of ThMs1 proteinwas detected by Western blot using specific anti-Ms1 antibodies. ThMs1 protein structure were predicted by SignalP software. The detection of lipid-binding activity of ThMs1 was performed by dot blot.【】The wheat-alien addition line harbored 4Ag chromosome from., the homolog of bread wheat male fertility gene, was cloned from the wheat-alien addition line. The functional complementation analysis confirmed that thecan completely restore the male fertility phenotype of the wheat. The phylogenetic analysis suggested that theonly exists in the Poaceae family. RT-PCR and qRT-PCR analysis confirmed thatgene was expressed in anthers during meiosis. RNAhybridization analysis revealed thatwas specifically expressed in microspore during wheat microsporogenesis. Western blot showed that ThMs1 was detected in wheat anther. The structure prediction analysis revealed that it has a predicted lipid binding domain, and protein lipid-binding experiments indicated that ThMs1 protein specifically binds PA and several phosphatidylinositols.【】A new male fertility gene,, was cloned from wheat-alien additiona line.exhibits similar expression pattern to that of.

bread wheat; wheat-alien addition line; recessive nuclear male sterility;;; wheat hybrid breeding system; molecular design

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.001

2020-09-20；

2020-10-30

北京市自然科學(xué)基金委-北京市教委聯(lián)合資助重點(diǎn)項(xiàng)目（IDHT20170513）

衡燕芳，E-mail：yanfangh@126.com。通信作者馬力耕，E-mail：ligeng.ma@cnu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）