李玉杰，程 才，向 剛，李曉娜*

(1.貴州師范大學(xué) 喀斯特研究院，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州省喀斯特山地生態(tài)環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

【研究意義】在喀斯特巖溶系統(tǒng)中，苔蘚植物是生物巖溶的重要參與者，其生理生態(tài)指標(biāo)除了能反應(yīng)自身代謝活性外，還與喀斯特環(huán)境有著顯著的關(guān)聯(lián)[1-3]，由于蘚類生理生態(tài)過(guò)程中釋放的酸性物質(zhì)及二氧化碳均對(duì)巖石有溶蝕作用，其生物過(guò)程所富集的營(yíng)養(yǎng)元素能給其他高等植物群落的產(chǎn)生提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，因此苔蘚植物生理生態(tài)研究對(duì)石漠化治理具有一定的實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葉綠素含量是植物生理生化及生態(tài)調(diào)查中的關(guān)鍵測(cè)量參數(shù)，能靈敏地反應(yīng)出植物的生理狀態(tài)與環(huán)境的相互關(guān)系，綠色度值(Soil and Plant Analyzer DevelopmentSPAD)是用于表征植物葉綠素相對(duì)含量的重要指標(biāo)，由于SPAD值能通過(guò)葉綠素測(cè)定儀快速測(cè)出，且能較好地反映植物葉綠素含量特征，常被用于農(nóng)作物健康狀況評(píng)估及植物生理生態(tài)研究中，其在水稻、蔬菜瓜果等研究中SPAD值與葉綠素含量的相互關(guān)系已有詳細(xì)報(bào)道[5-8]，林草業(yè)方面的相關(guān)研究也有所及[9-11]，且均取得了較為顯著的成果，可見(jiàn)SPAD值對(duì)于植物生理生態(tài)監(jiān)測(cè)具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502)具備探孔小、精度高等優(yōu)勢(shì)，其在葉片薄而小的蘚類植物上的應(yīng)用未有相關(guān)文章報(bào)道。因此選取了石漠化地區(qū)廣泛分布的2種蘚類尖葉對(duì)齒蘚(Didymodonconstrictus)和穗枝赤齒蘚(Erythrodontiumjulaceum)，運(yùn)用SPAD-502進(jìn)行葉片SPAD值測(cè)定?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探討蘚類植物SPAD值與對(duì)應(yīng)葉綠素含量的相互關(guān)系，同時(shí)對(duì)不同石漠化程度中蘚類植物葉綠素含量的空間分異進(jìn)行對(duì)比，揭示其分異規(guī)律并分析原因，為石漠化區(qū)域生態(tài)監(jiān)測(cè)及生態(tài)修復(fù)提供蘚類植物層面的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

撒拉溪示范區(qū)位于貴州省畢節(jié)市西南部，喀斯特面積占總面積的74 %，是我國(guó)西南地區(qū)典型的喀斯特地貌主導(dǎo)區(qū)域，為石漠化治理的綜合示范區(qū)，區(qū)域內(nèi)不同石漠化等級(jí)均有分布。區(qū)域內(nèi)高原山地生態(tài)環(huán)境占主導(dǎo)，主要出露石灰?guī)r及部分砂巖，地貌類型以峰叢洼地為主。示范區(qū)主要包括9個(gè)行政村，總?cè)丝跀?shù)為20 215人，植被類型為亞熱帶常綠針-闊葉林以及落葉闊葉林，區(qū)內(nèi)多年平均降水量為984.40 mm，年均溫為12.3 ℃。長(zhǎng)期以來(lái)，由于人為活動(dòng)原因，原生植物破壞嚴(yán)重，優(yōu)勢(shì)植物種群主要為櫟類(Quercusspp.)、火棘(Pyracanthafortuneana)和杜鵑(Rhododendronspp.)等藤刺灌叢，石漠化環(huán)境問(wèn)題凸顯。

1.2 方法

1.2.1 蘚類樣本采集 采樣時(shí)間為2018年8月16號(hào)(采樣前3 d無(wú)降水)，在不同石漠化等級(jí)區(qū)(無(wú)石漠化、輕度石漠化、中度石漠化和強(qiáng)度石漠化)隨機(jī)取撒拉溪廣泛分布的尖葉對(duì)齒蘚和穗枝赤齒蘚各10個(gè)樣，共計(jì)80個(gè)樣本。各取樣點(diǎn)光照度、植被蓋度和坡向見(jiàn)表1。

1.2.2SPAD值和葉綠素含量測(cè)定 (1)SPAD值測(cè)定。取樣時(shí)使用SPAD-502測(cè)定儀對(duì)所采苔蘚進(jìn)行測(cè)量并記錄SPAD值，每個(gè)樣本測(cè)10次，測(cè)定后將樣本裝入牛皮紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定。

(2)葉綠素含量測(cè)定。測(cè)定前用少量蒸餾水噴洗樣本除去表面雜質(zhì)，置于通風(fēng)干燥環(huán)境中24 h后以備實(shí)驗(yàn)。為保證測(cè)定結(jié)果盡可能不受到樣品存放時(shí)長(zhǎng)的影響，葉綠素的提取與測(cè)定采用邱念偉等的快速提取測(cè)定法[12]，將所測(cè)苔蘚樣本均勻剪碎，取100 mg置于10 mL的試管中，加入2 mL的DMSO浸潤(rùn)，在65 ℃的避光環(huán)境中提取直至樣品變白，待樣品冷卻后加入8 mL 80 %的丙酮混合均勻，用分光光度計(jì)測(cè)量其波長(zhǎng)為663.6和646.6 nm處的吸光度，計(jì)算葉綠素含量。

Chla(mg/L)=12.27A663.6-2.52A646.6

Chlb(mg/L)=20.10A646.6-4.92A663.6

Chl=Chla+Chlb

葉綠素含量(mg/g)=(色素濃度×提取液的體積)/樣品重

式中，Chla、Chlb和Chl分別為葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素總含量，A663.6和A646.6分別為葉綠素提取液在663.6和646.6 nm處的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin和Canoco 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPAD值與葉綠素含量

從表2看出，尖葉對(duì)齒蘚SPAD最小值和最大值分別為7.2和35.6，對(duì)應(yīng)的葉綠素總量(Chl)值和最大值分別0.158和0.816 mg/g。穗枝赤齒蘚SPAD最小值和最大值分別為12.6和40.9，對(duì)應(yīng)葉綠素總量最小值和最大值分別為0.418和 0.972 mg/g。雖然穗枝赤齒蘚SPAD最小值并未對(duì)應(yīng)葉綠素總含量最小值，但總體看來(lái)，隨著SPAD值的增加，葉綠素總含量基本呈上升趨勢(shì)。

表1 不同石漠化等級(jí)樣點(diǎn)的特征

表2 2種蘚類80個(gè)樣品的SPAD值和葉綠素含量

續(xù)表2 Continued table 2

2.2 SPAD值與葉綠素含量的相關(guān)性

運(yùn)用對(duì)數(shù)、指數(shù)及乘冪函數(shù)對(duì)2種蘚類植物SPAD值與各葉綠素含量進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表3)表明，SPAD值與葉綠素a、葉綠素b含量的擬合程度具有差異性，同等函數(shù)下葉綠素b與SPAD值的相關(guān)性均低于葉綠素a，原因主要是葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502)的發(fā)射波長(zhǎng)為660 nm，而葉綠素a和葉綠素b的吸收波長(zhǎng)分別為663.6和646.6 nm，SPAD-502的波長(zhǎng)更為接近葉綠素a的吸收波長(zhǎng)，所以導(dǎo)致了SPAD值測(cè)量結(jié)果對(duì)葉綠素b含量有更大的偏差。由于SPAD測(cè)定儀器操作與設(shè)計(jì)的局限性，植株接受測(cè)量部位的性狀特征如伸展度、厚度等因素有可能影響SPAD值測(cè)量結(jié)果。

由圖2可知，隨著石漠化程度的加重，2種蘚類葉綠素總含量與SPAD值間的相關(guān)性均逐漸減小。以尖葉對(duì)齒蘚為例，其葉綠素總含量與SPAD值線性擬合方程R2從0.90降至0.61；葉綠素a則從0.86降至0.72；葉綠素b降幅更明顯，從0.81降至0.24，降幅最明顯的均為輕度石漠化至中度石漠化階段，中度石漠化至強(qiáng)度石漠化雖有所降低，但降幅有所緩解。石漠化的加劇使得環(huán)境條件越來(lái)越惡劣，缺少植被保護(hù)的情況下陽(yáng)光可直接作用于苔蘚層，使得蘚類植物葉片因蒸發(fā)失水而處于干卷萎黃的失活狀態(tài)，葉片的卷曲團(tuán)縮的情況下測(cè)量的精度會(huì)受到一定影響，尤其是對(duì)含量最少的葉綠素b影響最大(含量越少，對(duì)精度要求就越高)，從而致使測(cè)量結(jié)果受到干擾而影響了擬合特性，但就SPAD值與葉綠素總含量的擬合性來(lái)說(shuō)，SPAD-502葉綠素測(cè)定儀所測(cè)結(jié)果仍然能很好地表征葉綠素總含量及其變化。

圖1 2種蘚類植物的SPAD值與葉綠素各成分含量的相關(guān)性Fig.1 Correlation between SPAD values and chlorophyll contents (chlorophyll, chlorophyll a and chlorophyll b) of two mosses

表3 4種函數(shù)下2種蘚的SPAD值與葉綠素各成分含量的擬合方程

2.3 石漠化環(huán)境中葉綠素含量的空間分異

2.3.1 葉綠素各成分含量的空間分異 從圖3看出，從無(wú)石漠化到強(qiáng)度石漠化過(guò)程中，尖葉對(duì)齒蘚和穗枝赤齒蘚SPAD值與葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總含量均都呈明顯下降趨勢(shì)，即石漠化程度越高則葉綠素含量越低，SPAD值也越低。其中SPAD值與葉綠素總含量趨勢(shì)十分接近，較好地反映葉綠素含量的空間變化趨勢(shì)，這也從另一個(gè)角度驗(yàn)證SPAD值用于表征2種蘚類葉綠素總含量及動(dòng)態(tài)變化的可行性。

圖2 不同石漠化程度下2種蘚的SPAD值與葉綠素含量的相關(guān)性Fig.2 Correlation between SPAD values and chlorophyll contents of two mosses under rocky desertification with different degrees

圖3 不同石漠化2種蘚的SPAD值及葉綠素含量Fig.3 SPAD values and chlorophyll contents of two mosses under rocky desertification with different degrees

從圖4看出，葉綠素含量與SPAD值呈顯著正相關(guān)，葉綠素含量與蔭蔽狀況也呈正相關(guān)，此外光照度和植被蓋度均與葉綠素含量呈顯著的負(fù)相關(guān)，坡向與葉綠素含量有一定負(fù)相關(guān)性，但不明顯。排序結(jié)果表明，在諸多石漠化環(huán)境因子中，植被蓋度和光照度因子對(duì)2種蘚類植物葉綠素含量的影響最顯著。植被蓋度的降低是喀斯特地區(qū)石漠化產(chǎn)生的最直觀因素，植被的減少將使喀斯特區(qū)域失去最主要的生態(tài)“保護(hù)傘”，缺少“保護(hù)傘”的情況下區(qū)域曝光度增加、水土流失嚴(yán)重，高溫干旱且貧瘠的石漠化環(huán)境接踵而至。

Vc為植被覆蓋度，Chl為葉綠素總含量，shade為遮陰狀況；asp為坡向，lux為光照度，圓圈為單個(gè)樣本，箭頭為各指標(biāo)數(shù)值，箭頭間的夾角表示各指標(biāo)的相關(guān)性，夾角越接近90°則相關(guān)性越差 Vc, Chl, shade, asp and lux mean vegetation coverage, total chlorophyll content, shade situation, aspect and illuminance respectively. Circle and arrow mean single sample and the value of each index. The included angle between arrows indicates the correlation between different indexes. The closer the angle to 90° is, the worse the correlation is 圖4 樣點(diǎn)環(huán)境因子及蘚的SPAD值與葉綠素總量各因子的PCA排序Fig.4 PCA ranking of sample environment factor, and SPAD value and factor of total chlorophyll content of two mosses

2.3.2 葉綠素a/b值的空間分異 葉綠素b能有效的捕捉并利用藍(lán)紫光進(jìn)行光合作用，因此，苔蘚作為陰生植物，其葉綠素a與葉綠素b的比值通常比陽(yáng)生植物的低，在1.5～3。通常來(lái)說(shuō)，弱光環(huán)境下植物葉片葉綠素a/b值較低而強(qiáng)光照環(huán)境下則會(huì)增升高，這通常被認(rèn)為是植物體適應(yīng)不同光環(huán)境的體現(xiàn)[13]。從圖5可知，在喀斯特環(huán)境下，石漠化程度的加劇對(duì)尖葉對(duì)齒蘚和穗枝赤齒蘚葉綠素a和葉綠素b的比值影響顯著，2種蘚類葉綠素a/b均值最大值均出現(xiàn)于強(qiáng)度石漠化區(qū)域，尖葉對(duì)齒蘚葉綠素a/b的平均值體現(xiàn)為從無(wú)石漠化到中度石漠化小幅遞減，到強(qiáng)度石漠化突然升至最大值，穗枝赤齒蘚則隨著石漠化過(guò)程的加劇葉綠素a/b的平均值不斷增高。

圖5 不同程度石漠化環(huán)境兩種蘚的葉綠素a/b值Fig.5 Chlorophyll a/b values of two mosses under rocky desertification with different degrees

3 討 論

由于蘚類植物葉片較小且不同種之間存在差異，植株體疏密程度不一等原因?qū)е耂PAD值測(cè)定困難，SPAD-502型號(hào)葉綠素測(cè)定儀探孔微小、測(cè)量精度高等特性為蘚類植物SPAD值測(cè)量提供了支撐，從測(cè)量結(jié)果看來(lái)，SPAD值與尖葉對(duì)齒蘚和穗枝赤齒蘚葉綠素各成分含量的關(guān)系在4種函數(shù)方程下擬合度均較好，雖然擬合結(jié)果對(duì)石漠化程度有一定分異性，但總體也能良好的體現(xiàn)出葉綠素含量的變化趨勢(shì)，因此，使用SPAD-502對(duì)該兩種蘚類進(jìn)行葉綠素相對(duì)含量測(cè)量是完全可行的。隨著蘚類生態(tài)生理研究的不斷深入，野外測(cè)量葉綠素含量等工作需尋求更有效便捷的方式，SPAD值測(cè)定具備不損傷植物體以及快速、精確等優(yōu)勢(shì)，不僅可以對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行快速估測(cè)，而且在連續(xù)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中更有不可忽視的優(yōu)越性。

隨石漠化程度加劇蘚類植物單位重量葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，葉綠素a/b值趨于增高，這是蘚類植物對(duì)于石漠化干旱及高曝光環(huán)境適應(yīng)的體現(xiàn)。石漠化高溫干旱環(huán)境下維管植物不宜生存[14]，在這種極端的環(huán)境條件中苔蘚植物生態(tài)位寬度得以增加，這一定程度上得益于蘚類植物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的適應(yīng)特征[15-16]，但蘚類植物生理調(diào)節(jié)特征也至關(guān)重要，在干旱的石漠化地區(qū)，蘚類植物可通過(guò)滲透調(diào)節(jié)作用來(lái)提高抗氧化酶系統(tǒng)的能力[17]，同時(shí)也具備在極端環(huán)境下維持光和色素含量、調(diào)控色素比率以保證光合機(jī)構(gòu)完整性的能力，這些特殊的生理調(diào)節(jié)與適應(yīng)能力讓蘚類植物在極端環(huán)境下也能生長(zhǎng)發(fā)育。

植物體中葉綠素的合成與分解是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，葉綠素含量受光照及溫度等因素影響，其中光照對(duì)葉綠素合成和分解起主要作用，光作為激發(fā)因子對(duì)葉綠素合成有至關(guān)重要的影響，在植物葉綠素合成的過(guò)程中，谷氨酰-t RNA(Glut RNA)接受光照刺激后開(kāi)始一系列的葉綠素合成過(guò)程，直至葉綠素b形成后總共需要16個(gè)步驟[18]，但在整個(gè)過(guò)程中不需要過(guò)強(qiáng)的光照度。此外，受光時(shí)植物葉片中Mg2+螯合酶活性會(huì)大大增強(qiáng)[19]，有利于葉綠素的進(jìn)一步合成。已有研究證實(shí)，弱光環(huán)境對(duì)植物葉綠素合成有促進(jìn)作用[20-22]，這是由于弱光或者遮光條件下植物葉片中集光色素蛋白含量增加而使得結(jié)合態(tài)葉綠素增多，葉綠素含量因此增加，這有利于植物在弱光環(huán)境下能高效地進(jìn)行光捕捉。石漠化地區(qū)溫度的變化很大程度上取決于光照強(qiáng)度及光照時(shí)長(zhǎng)，溫度通過(guò)影響酶活性從而影響植物光合色素的分解與合成，高溫或者低溫均可能導(dǎo)致植物酶活性降低從而影響葉綠素合成與分解過(guò)程，但通常來(lái)說(shuō)，隨石漠化程度的增加，植被覆蓋率降低，夏季地表曝光度不斷增加將會(huì)導(dǎo)致溫度升高，高溫脅迫下，植物葉綠素含量將會(huì)下降[23-24]。坡向在一定程度上可改變區(qū)域環(huán)境的光照條件及降水條件等[25]，但通常與宏觀的大尺度地貌相關(guān)聯(lián)，撒拉溪多以低矮的峰叢洼地為主，因此坡向因子對(duì)區(qū)域環(huán)境光照及溫濕度條件影響有限。在喀斯特石漠化環(huán)境中，植被蓋度對(duì)蘚類植物葉綠素含量的影響體現(xiàn)在其對(duì)光照環(huán)境及溫度環(huán)境的影響上，無(wú)石漠化到強(qiáng)度石漠化過(guò)程中，植被蓋度不斷降低，同時(shí)段地表單位面積光強(qiáng)度隨之增加，蘚類植物在光照不斷變強(qiáng)的情況下葉綠素合成將會(huì)受到阻礙。陽(yáng)光的暴曬致使地層溫度升高、植物蒸騰作用增強(qiáng)，高溫干旱將直接導(dǎo)致植株體失去活性，此時(shí)大量葉綠素將會(huì)以游離的形態(tài)出現(xiàn)于細(xì)胞中，這種游離態(tài)的葉綠素會(huì)對(duì)葉細(xì)胞造成光氧化損傷，從而迫使植物體必須快速降解游離葉綠素以保證植株體的正常代謝功能[26]。

由于缺少植被覆蓋，石漠化地表層具有高曝光性，且隨石漠化的加劇光照越來(lái)越強(qiáng)烈，植物葉片對(duì)高強(qiáng)度光照的適應(yīng)策略除了降低單位質(zhì)量葉綠素含量以外，還包括增加葉綠素a/b值。葉綠素a與葉綠素b合成和分解的速度影響了葉綠素a/b值的大小，一般來(lái)說(shuō)，在強(qiáng)度石漠化環(huán)境下，強(qiáng)光照條件導(dǎo)致葉綠素以降解和光氧化的形勢(shì)分解減少，而葉綠素b分解速率要高于葉綠素a，但在弱光或者遮光環(huán)境中葉綠素a會(huì)以水解形勢(shì)部分轉(zhuǎn)化為葉綠素b[27]，這就導(dǎo)致了無(wú)石漠化環(huán)境中兩種蘚類植物葉綠素a/b值低于強(qiáng)度石漠化環(huán)境，但石漠化過(guò)程中尖葉對(duì)齒蘚葉綠素a/b值并未呈現(xiàn)出穗枝赤齒蘚那樣的遞增趨勢(shì)，而是體現(xiàn)為在無(wú)石漠化環(huán)境、輕度石漠化環(huán)境及中度石漠化環(huán)境中略微減小，爾后強(qiáng)度石漠化環(huán)境中突然增大至最大值，這可能體現(xiàn)了尖葉對(duì)齒蘚在輕中度石漠化環(huán)境中具備更好的適應(yīng)能力，如尖葉對(duì)齒蘚葉片細(xì)胞具有“疣”， 這種葉細(xì)胞上的疣狀突起能有效反射太陽(yáng)輻射，有助于植物體保持低溫低蒸發(fā)狀態(tài)，此外尖葉對(duì)齒蘚葉片具有中肋結(jié)構(gòu)，較無(wú)中肋結(jié)構(gòu)的穗枝赤齒蘚更具水分傳導(dǎo)能力，從而使得葉片能有效維持一定的含水量，這些特殊的生理適應(yīng)結(jié)構(gòu)有效地抑制了葉綠素的氧化分解，讓葉綠素a/b比值趨于穩(wěn)定[28]。

4 結(jié) 論

2種蘚類植物SPAD值與葉綠素各成分含量在4種函數(shù)(線性、對(duì)數(shù)、指數(shù)、乘冪)擬合下均顯著相關(guān)，葉綠素a較葉綠素b有更好的相關(guān)性，石漠化程度加劇而導(dǎo)致的2種蘚類植物干卷萎縮會(huì)對(duì)SPAD值測(cè)量精度產(chǎn)生影響，但總體上SPAD值仍然能理想地表征2種蘚類植物的葉綠素總含量。隨石漠化程度的增加，2種蘚類植物會(huì)通過(guò)降低葉綠素含量以及增加葉綠素a/b值來(lái)適應(yīng)石漠化地區(qū)惡劣的生態(tài)環(huán)境。蘚類植物在適應(yīng)石漠化環(huán)境的同時(shí)也對(duì)石漠化環(huán)境產(chǎn)生影響，其植物體具備強(qiáng)大的吸水固土能力，能有效減少石漠化地區(qū)的水土流失[29]，改善區(qū)域微環(huán)境的溫濕度[30]及加速巖溶地區(qū)成土過(guò)程[31]以及抑制喀斯特礦區(qū)重金屬污染的擴(kuò)散[32]等作用，為石漠化地區(qū)植被群落的正向演替提供了良好的基礎(chǔ)，因此，蘚類植物作為先鋒植物應(yīng)用于石漠化生態(tài)修復(fù)初級(jí)階段具備較大潛力，石漠化地區(qū)蘚類植物生理生態(tài)監(jiān)測(cè)工作也需要得到更多的重視。