李 樾，袁 智，劉 麗

(1.湖北工程學(xué)院 新技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

浮游病毒(Virioplankton)是指懸浮在水層中各類病毒的總稱，一般呈長(zhǎng)短尾蝌蚪形、紡錘形、球形等形態(tài)[1-4]，噬菌體與噬藻體是其主要類群[5]。研究表明浮游病毒對(duì)引起水華現(xiàn)象的浮游藻類具有控制作用[6-7]，浮游病毒研究已經(jīng)成為科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)方法很難對(duì)浮游病毒多樣性、病毒動(dòng)態(tài)變化及未知病毒進(jìn)行全面的了解，而宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)為病毒的檢測(cè)及微生物遺傳多樣性分析提供了新方法。病毒宏基因組學(xué)(Viral metagenomics)不需要已知核酸序列，而是直接以病毒樣品的總核酸為研究對(duì)象，可以快速鑒定樣品中病毒物種，既豐富了病毒庫(kù)數(shù)據(jù)，也對(duì)病毒檢測(cè)、病毒多樣性、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病毒動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)等研究具有重要的價(jià)值[8]。病毒宏基因組技術(shù)在醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[8-9]和環(huán)境體系[10-11]顯示出巨大的優(yōu)越性，對(duì)病毒的物種組成、系統(tǒng)研究、疾病預(yù)防及通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)病毒與宿主的互相作用具有重要意義。

本文回顧并比較了浮游病毒多樣性研究的相關(guān)分子技術(shù)發(fā)展及優(yōu)缺點(diǎn)，綜述了近年來(lái)基于宏組技術(shù)在浮游病毒多樣性研究中的應(yīng)用，為不同環(huán)境中未知病毒的識(shí)別提供數(shù)據(jù)支撐，為水生態(tài)系統(tǒng)的污染防治提供科學(xué)依據(jù)，從而豐富我國(guó)水生態(tài)病毒學(xué)的理論體系。

1 遺傳多樣性研究的分子技術(shù)

研究人員發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性越高的物種，對(duì)環(huán)境和氣候變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，分布的范圍也越廣[12]。遺傳多樣性的研究有助于完善物種分類、分析進(jìn)化關(guān)系、探究與宿主互作機(jī)制等[13]。目前，應(yīng)用于浮游病毒多樣性研究的分子技術(shù)主要包括克隆文庫(kù)分析法、核酸探針技術(shù)、基因芯片和宏基因組文庫(kù)等。

克隆文庫(kù)分析法是提取樣品總DNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、連接、克隆、測(cè)序后與已知的數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析研究浮游病毒群落多樣性?？寺∥膸?kù)應(yīng)用在群落多樣性研究中需要注意有廣泛的通用分子標(biāo)記基因，而高度差異性的病毒類群因缺乏通用的分子標(biāo)記基因?qū)е伦罱K分析結(jié)果有誤。常用的靶基因主要有病毒衣殼組裝蛋白的g20基因[14-15]、DNA聚合酶基因[16]、編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白的光合基因psbA[17-21]等。由于病毒的種類較多而g20基因僅存在于肌尾病毒中、DNA聚合酶基因主要存在于短尾病毒中、psbA基因廣泛存在于短尾病毒和肌尾病毒中，因此g20基因、DNA聚合酶基因、psbA基因作為遺傳多樣性的標(biāo)記基因在多樣性研究存在一定局限性[22]。

核酸探針檢測(cè)技術(shù)是一種通過(guò)特異性核酸探針檢測(cè)樣品中待測(cè)靶序列的方法。其中，核酸探針通常選用放射性同位素或熒光染料作為標(biāo)記。該技術(shù)具備靈敏性和特異性高的特點(diǎn)，從而被廣泛應(yīng)用于多樣性研究中。Wommack等[1]基于此技術(shù)對(duì)切薩皮克海灣的浮游病毒群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)浮游病毒通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方式影響其宿主的遺傳多樣性。應(yīng)用此技術(shù)的局限性是特異性標(biāo)記的探針須為病毒數(shù)據(jù)庫(kù)的已知序列，因此不能挖掘新的病毒基因且難以獲得全面的遺傳多樣性數(shù)據(jù)[5]。

基因芯片又稱生物芯片，是一種微量分析技術(shù)，是將標(biāo)記的樣品與固定在支持物上的大量探針?lè)肿与s交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度分析樣品相關(guān)信息，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品分子的大規(guī)模檢測(cè)分析。此方法的缺點(diǎn)是標(biāo)記的探針須為病毒數(shù)據(jù)庫(kù)的已知序列，因此也不能發(fā)現(xiàn)新的病毒基因。

宏基因組(Metagenome)概念由威斯康辛大學(xué)的Handelsman等在1998年提出，指自然界特定環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)總和[23]。宏基因組學(xué)(metagenomics)是研究環(huán)境樣品中所包含的全體微生物的遺傳物質(zhì)組成、群落結(jié)構(gòu)功能的研究手段。因其通過(guò)對(duì)微生物的核酸物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序來(lái)分析微生物群落物種組成與功能多樣性，所以又稱微生物環(huán)境基因組學(xué)。值得注意的是隨著該方法的應(yīng)用及生命科學(xué)的發(fā)展，不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物的認(rèn)知與研究不再是困擾學(xué)者的難題。因?yàn)楹杲M技術(shù)不再需要依賴于微生物分離培養(yǎng)技術(shù)[24-32]。

2 病毒宏基因技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 病毒宏基因組技術(shù)

病毒宏基因組學(xué)是基于宏基因組學(xué)技術(shù)而發(fā)展的一個(gè)新的學(xué)科分支，又稱宏病毒組學(xué)。該技術(shù)有一套科學(xué)的流程，包括病毒樣品總核酸提取、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析。必須注意的是宏病毒組建庫(kù)測(cè)序不同于一般的宏基因組技術(shù)，需要對(duì)病毒顆粒進(jìn)行富集。筆者在應(yīng)用宏組技術(shù)探究不同湖泊中浮游病毒多樣性差異的流程如圖1所示，基于此技術(shù)對(duì)病毒的物種組成和功能注釋分析不同環(huán)境中的病毒群落結(jié)構(gòu)及功能，發(fā)現(xiàn)高原湖泊中浮游病毒遺傳多樣性十分豐富，且存在大量未知病毒。

圖1 病毒宏基因組學(xué)技術(shù)分析流程

病毒宏基因組學(xué)在探究未知病毒、追溯病原、疾病預(yù)防等方面具有重要實(shí)用價(jià)值。先前的病毒調(diào)查結(jié)果表明病毒具有豐富的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)約60%～99%的環(huán)境病毒序列與病毒數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)同源性[33-35]。2007年，Bench等[36]基于宏病毒方法對(duì)切薩皮克灣的浮游病毒分析發(fā)現(xiàn)該地區(qū)含有大量未知浮游病毒序列(僅與環(huán)境序列同源)和新序列(無(wú)顯著同源)，并表明dsDNA病毒可能是生物圈中未知的遺傳多樣性的最為豐富種群之一。Ng等[33]在2009年對(duì)佛羅里達(dá)綠海龜纖維乳頭瘤組織構(gòu)建宏組文庫(kù)分發(fā)現(xiàn)了一株新型的單鏈DNA病毒，表明病毒宏基因組技術(shù)直接從樣品中發(fā)現(xiàn)新病毒方面的潛力，增加了我們對(duì)病毒進(jìn)化和多樣性的理解。Willner等[37]應(yīng)用此技術(shù)首次研究患有呼吸道疾病人群和健康人群的病毒群落，發(fā)現(xiàn)呼吸道患者中的病毒多樣性很低。2010 年，Coetzee 等[38]提取南非葡萄園中感染病毒葡萄藤的遺傳物質(zhì)進(jìn)行深度測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)新病毒的存在和4株已知的病毒病原體。Donaldson等[39]利用此技術(shù)對(duì)北美地區(qū)一個(gè)廢棄鐵路隧道中蝙蝠的糞便、口腔、尿液和組織樣本分析發(fā)現(xiàn)7-10個(gè)種屬蝙蝠群落，還發(fā)現(xiàn)許多昆蟲(chóng)病毒、植物病毒和一株新型冠狀病毒，表明蝙蝠是病毒傳播途徑之一。Day等[40]對(duì)患病火雞腸道內(nèi)RNA病毒測(cè)序后數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)許多病毒同源序列。

2.2 宏病毒組技術(shù)在浮游病毒多樣性研究中的應(yīng)用

大量的研究表明浮游病毒不僅具有調(diào)節(jié)宿主群落結(jié)構(gòu)的作用，還能夠通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移影響生物地球化學(xué)循環(huán)[41-43]。不同自然條件下不同浮游病毒群體之間具有一定的差異，海洋和淡水等水域中的浮游病毒已經(jīng)成為生態(tài)學(xué)研究的重點(diǎn)課題。

2002年，Breitbart等[44]首次應(yīng)用宏組技術(shù)對(duì)美國(guó)加州的2處沿海區(qū)域浮游病毒群落分析，結(jié)果表明海洋中病毒群落多樣性非常豐富，大約包含374至7114種病毒類型。Angly等[45]基于此技術(shù)對(duì)來(lái)自北冰洋、不列顛哥倫比亞的海岸、墨西哥灣和馬尾藻海的184個(gè)海洋病毒群落結(jié)構(gòu)及分布特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)病毒物種組成存在地域性差異，病毒多樣性很高且在低緯度地區(qū)更豐富。2004年，Breitbart等[24]將宏組技術(shù)與數(shù)學(xué)模型相結(jié)合對(duì)近岸區(qū)域的海洋沉積物病毒群落分析，結(jié)果表明海洋沉積物病毒群落是遺傳多樣性最豐富的生物群體之一，且每1 kg沉積物中至少有104個(gè)病毒基因型。2009年，Sharon等[46]比較分析已知的海洋病毒生物群落和宏基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)構(gòu)成藍(lán)藻光合系統(tǒng)I的基因序列存在于噬藻體的基因組中，揭示了其在病毒生命周期中的獨(dú)特功能。塔拉海洋探險(xiǎn)隊(duì)[47]歷經(jīng)兩年半的時(shí)間，對(duì)采集的表層及中層海水的海洋病毒調(diào)查發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性豐富，經(jīng)過(guò)分析鑒定揭示了巨病毒科病毒和卵菌之間的橫向基因轉(zhuǎn)移聯(lián)系，表明宏基因組序列分析有望為海洋病毒的生物多樣性及其與潛在宿主的相互作用提供新的線索。2015年，汪儉[48]基于宏組技術(shù)探究我國(guó)的北黃海海洋病毒群落特征發(fā)現(xiàn)肌尾病毒科病毒豐度最高，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)許多未知病毒序列。2016年，夏駿等[49]基于此技術(shù)分析我國(guó)渤海的海洋病毒群落特征，經(jīng)分析均發(fā)現(xiàn)海水中肌尾病毒科病毒豐度最高且渤海地區(qū)秋季浮游病毒多樣性高于冬季。2017年，Claire等[50]持續(xù)八年時(shí)間研究分析南極半島西部(WAP)沿海地區(qū)的浮游病毒豐度變化規(guī)律及其驅(qū)動(dòng)因素，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域具有明顯的季節(jié)性周期變化且夏季豐度最高，推斷是浮游細(xì)菌的變化導(dǎo)致的浮游病毒的年際差異。

宏基因組學(xué)極大地?cái)U(kuò)展了已知的病毒圈，但淡水病毒的多樣性仍然知之甚少，主要集中在黃石溫泉、南極湖、撒哈拉沙漠淡水池塘、我國(guó)臺(tái)灣的水庫(kù)等。2008年，Schoenfeld等[51]首次基于此技術(shù)對(duì)黃石公園兩個(gè)堿性溫泉(74 ℃和93 ℃)的嗜熱病毒研究，發(fā)現(xiàn)其病毒多樣性與中溫環(huán)境相似性較高，與陸地分離的病毒也有一定的相似性。Dinsdale等[52]基于宏組方法分析海洋、淡水、鹽湖等9個(gè)病毒群落的遺傳信息和代謝過(guò)程，結(jié)果表明各群落的功能多樣性相似，但代謝特征有所不同。2009年，Alberto等[53]利用此技術(shù)對(duì)南極湖病毒群落的遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)大量未知真核病毒，且春夏季病毒物種的轉(zhuǎn)化與宿主群落的季節(jié)性變化相關(guān)。Djikeng等[34]利用宏病毒組技術(shù)對(duì)美國(guó)馬里蘭州一個(gè)淡水湖泊中RNA病毒調(diào)查研究，將測(cè)序所得的數(shù)據(jù)與病毒數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)30多個(gè)RNA病毒家族并且存在大量的未知病毒序列。Rosario等[35]基于此技術(shù)分析廢水處理廠再生水中病毒群落特征并與飲用水中的病毒比較，發(fā)現(xiàn)大量與昆蟲(chóng)、動(dòng)植物病毒相關(guān)的新型病毒，推斷再生水可能在病毒傳播中發(fā)揮作用。2011年，Sime等[54]對(duì)非洲西部的雷特巴鹽湖中病毒顆粒構(gòu)建宏基因組文庫(kù)進(jìn)行多樣性研究，發(fā)現(xiàn)許多與已知數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配的新序列。2012年，Roux等[55]基于宏組技術(shù)對(duì)兩個(gè)生境差異明顯的法國(guó)溫帶淡水湖泊病毒群落的組成和多樣性分析發(fā)現(xiàn)中營(yíng)養(yǎng)湖泊的物種豐度高于貧營(yíng)養(yǎng)湖泊，并且與先前發(fā)表的病毒信息對(duì)比首次發(fā)現(xiàn)淡水環(huán)境病毒群落與其他水生生態(tài)系統(tǒng)在遺傳上顯示出特異性。2013年，F(xiàn)ancello等[56]對(duì)撒哈拉沙漠中部四個(gè)池塘的浮游病毒群落進(jìn)行宏組研究，結(jié)果顯示人類活動(dòng)多的地區(qū)病毒生物多樣性較低且肌病毒科噬藻體最為豐富。2016年，Skvortsov等[57]對(duì)來(lái)自愛(ài)爾蘭內(nèi)伊湖的浮游病毒群落進(jìn)行宏組分析，發(fā)現(xiàn)浮游病毒多樣性比之前研究湖泊更為豐富，其中以短尾病毒科為主要部分。2019年，Okazaki等[58]對(duì)日本的深淡水湖(琵琶湖)浮游病毒進(jìn)行基因組探索，并與自己已發(fā)表的病毒基因組比較揭示了病毒的地域性特點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)放線菌病毒是淡水系統(tǒng)中最多樣化的、最普遍、最豐富的病毒群之一，在地表水中具有潛在的溶菌活性。

宏病毒技術(shù)發(fā)展至今，國(guó)內(nèi)淡水環(huán)境浮游病毒多樣性的相關(guān)研究還比較少。2012年，Tseng等[59]對(duì)我國(guó)臺(tái)灣北部的翡翠淡水水庫(kù)的浮游病毒多樣性進(jìn)行為期兩年的宏組分析，發(fā)現(xiàn)夏季病毒豐度及多樣性顯著超過(guò)冬季，變異病毒主要集中在長(zhǎng)尾病毒科、肌病毒科、短尾病毒科和微病毒科。2013年，Ge等[60]對(duì)我國(guó)武漢東湖浮游病毒群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行宏組分析發(fā)現(xiàn)，浮游病毒多樣性在秋季最高，其次是冬季，而春季最低。2016年，Cai等[61]對(duì)我國(guó)福建九龍江河口病毒群落特征初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)短尾病毒科病毒豐度最高。筆者基于宏病毒技術(shù)對(duì)四大高原湖泊中的浮游病毒多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)尾病毒科的豐度最高，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)存在大量未知病毒序列[62]。

3 總結(jié)與展望

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于病毒的研究一直局限于從受感染宿主中分離，因其缺乏廣泛的通用分子標(biāo)記基因，導(dǎo)致一般的生物技術(shù)很難獲得完整的病毒序列。而宏病毒組分析技術(shù)的建立開(kāi)辟了一條新的道路，擺脫了物種界限，并揭示了復(fù)雜的生命規(guī)律，已成為環(huán)境和組織研究中病毒組成和功能的重要技術(shù)。雖然宏組技術(shù)已被證明是一種強(qiáng)大的工具，能夠?qū)颖局写嬖诘乃泻怂徇M(jìn)行測(cè)序，從而不需要預(yù)先了解微生物基因組序列就可以對(duì)其身份識(shí)別，但是，宏組技術(shù)還存在明顯的局限性：1)需要對(duì)病毒顆粒進(jìn)行富集以滿足建庫(kù)要求。宏病毒組分析的前提是要保證核酸物質(zhì)的質(zhì)量和構(gòu)建文庫(kù)的覆蓋率要滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，所以環(huán)境病毒樣品處理與篩選尤為重要。2)需要其他工具的協(xié)助來(lái)增強(qiáng)其應(yīng)用。已知的病毒注釋數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)量有限，基于宏組技術(shù)測(cè)序樣品產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)需要很長(zhǎng)的計(jì)算時(shí)間，需要其他工具的輔助對(duì)單個(gè)病毒序列進(jìn)行聚類、分類和識(shí)別。如結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析方法識(shí)別元基因組中每個(gè)序列的同源性。

浮游病毒因在海洋、湖泊等水生態(tài)系統(tǒng)的重要地位已成為許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注焦點(diǎn)。相對(duì)于國(guó)外來(lái)說(shuō)，我國(guó)有關(guān)浮游病毒的研究起步較晚，僅限于個(gè)別海洋、淡水湖泊等，而對(duì)于其他地區(qū)浮游病毒多樣性的研究還有待深入。