任永超

摘要：為了提高當歸及其混偽品的分子鑒定結(jié)果的可靠性，研究了一種當歸及其混偽品的分子鑒定技術。先對當歸材料及其混偽品的trn L-F序列和ropC1序列進行了基因序列擴增和測序，引入DNA條形碼鑒定技術，鑒定當歸及其混偽品的分子，最后通過trn L-F序列有效區(qū)分出了所有的當歸及其混偽品的分子，而rpoC1序列僅能區(qū)分部分當歸和其混偽品。

關鍵詞：分子鑒定技術；當歸；混偽品；遺傳信息；基因序列

引言

當歸屬于傘形科類植物，味道比較甘甜，稍帶辣味且性暖，對于人體來說具有補血活血、調(diào)理經(jīng)絡、止疼以及通便之功效。在臨床上通常將當歸用于血虛血瘀、眩暈心悸，治理女性的月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)痛經(jīng)、虛寒腹痛以及風濕關節(jié)炎等疾病，對于皮外傷、癰痛以及腸燥便秘等病狀也具有顯著療效。

到目前為止，當歸藥材的鑒定方法主要有基原、性狀、顯微、理化、生物等。但是這些鑒定方法都對相關的鑒定人員有著較高的經(jīng)驗要求，且具有主觀性強、通用性差等明顯缺陷，不利于當歸藥材鑒定方法的標準化建立、發(fā)展以及大力推廣。近年來，伴隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，將遺傳物質(zhì)DNA鑒定方法應用到當歸藥材的鑒定方法中去已經(jīng)成為當今的主流研究方向。當歸藥材中的基因信息直接通過DNA在藥材分子間傳遞，且在同一個生物體內(nèi)，每一種藥材細胞都包含著相同的遺傳信息，在遺傳上具有較強的穩(wěn)定性，不會輕易因外界因素的影響而發(fā)生變化。DNA分子鑒定技術為當歸藥材鑒定問題的解決提供了客觀、快速、有效的依據(jù)，因此本文主要研究了一種當歸及其混偽品的分子鑒定技術。

當歸及其混偽品的分子鑒定

利用NCBI的BLAST相似性，對當歸及其混偽品的trn-L-F序列和rpoC1序列進行搜索，如果兩個序列都可以被搜索到，說明trn-L-F序列和rpoC1序列具有很好的匹配度，將其看作是目標序列。用megav.5.0化學成分分析軟件計算trn-L-F序列和rpoC1序列在當歸及其混偽品中的組成情況以及平均G+C含量（%），并計算出每一種分子序列的堿基變異數(shù)、信息位點、相同堿基數(shù)量以及轉(zhuǎn)換/轉(zhuǎn)化等信息。

作為一種新的物種鑒定方法，DNA條形碼技術可以通過分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來顯示植物體內(nèi)基因序列的具體信息，并直觀準確地作出判斷，彌補了傳統(tǒng)鑒定方法的不足。DNA條形碼鑒定方法不僅可以明確物種之間的差異，還可以明確較小物種內(nèi)部的差異。DNA片段要盡可能短，才能方便DNA序列提取和PCR序列擴增，因此一般引物設計要高度保守。

通過由trn-L-F序列構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹可以將當歸藥品聚類為一個分支，并對聚類結(jié)果進行分析，從而確定所有相關物種在一個分枝上都能聚集成一個具有高度親和力的物種群，也就是理論上利用trn-L-F序列可以構(gòu)建一個當歸識別數(shù)據(jù)庫，從而識別當歸及其混偽品之間的區(qū)別。接下來的工作中，只需放大trn-L-F序列，并與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較，即可確定鑒定結(jié)果的真實性。但由rpoC1序列構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹不能很好地區(qū)分各屬的關系，所以trn-L-F序列更適合于當歸及其混偽品的鑒定。但是該序列鑒定功能不強，可作為輔助鑒定工具，并與其他基因結(jié)合進行鑒定。該規(guī)律說明，trn-L-F基因?qū)Ξ敋w品種的種間鑒別優(yōu)于rpoC1基因，能夠完全區(qū)分真假當歸，具有較高的應用價值。

用葉綠體基因組片段trn L-F序列擴增當歸及其混偽品發(fā)現(xiàn)，SNP的21位特異性鑒定位點為當歸。有9個堿基A在273-284處連續(xù)重復，但片段中的堿基A重復次數(shù)不同，或含有其他堿基，因此也可根據(jù)此區(qū)分當歸及其偽混品。另外，在trn-L-F序列基礎上構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹表明，純當歸本身具有與其他摻假物明顯不同的擴展性。但是在不同產(chǎn)地的當歸樣品上trn-L-F和rpoC1這兩個序列并沒有很大差別。由trn-L-F和rpoC1序列構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生樹表明，目前市場上三種商品當歸藥材與正品當歸相差甚遠，證明這三種原料都是假藥，應謹慎使用。

結(jié)束語

本文主要研究了當歸及其混偽品的分子鑒定技術，在分子鑒定方面，利用trn-L-F序列能有效地區(qū)分當歸、混偽品與近緣種，而rpoC1序列只能區(qū)分部分當歸、混偽品與近緣種，而部分明確區(qū)分白芷、阿壩當歸等樣品，且鑒定效率低下，這為當歸市場中提供了一種快速有效的鑒定方法，對當歸產(chǎn)品DNA條碼的補充和完善具有重要意義。

基金項目：

貴州省2017年度黔南州社會發(fā)展科技計劃項目“黔南地區(qū)當歸道地性相關的遺傳信息研究”（編號：黔南科合社字（2017）1號）