劉文彩，黃 鵬

(1.南昌大學(xué)a.第一臨床醫(yī)學(xué)院2018級；b.公共衛(wèi)生學(xué)院循證醫(yī)學(xué)中心；2.江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，南昌 330006)

弓形蟲病正感染著全球超過30%的人口，逐漸成為一種全球性健康危害[1]，在我國弓形蟲感染率也超過10%[2]。臨床上該病主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害(如腦炎、癲癇、精神異常)以及孕婦的流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎或死胎，其中畸胎發(fā)生率最高，且會傳染給胎兒[3]。本文擬對人弓形蟲病診斷方法的發(fā)展進(jìn)行綜述，以期為人弓形蟲病的診斷提供更多選擇。

1 傳統(tǒng)診斷方法

1.1 病原學(xué)診斷

病原學(xué)檢查主要通過對患者組織、體液或用其接種培養(yǎng)出的生物樣本進(jìn)行鏡檢，以觀察到寄生蟲作為診斷依據(jù)。此類檢查簡單方便，具有確診意義，但陽性率不高，易漏檢。

1.1.1 涂片染色法

取急性期患者的各種體液如腦脊液、胸腔積液、腹水、羊水、痰液、骨髓或血液等，進(jìn)行離心后取沉淀物制作涂片，或采用組織切片經(jīng)吉姆薩(Giemsa)染液染色后直接鏡檢檢測弓形蟲滋養(yǎng)體[4]?；蛴眠@些體液和組織制片使用間接熒光染色法檢測：置于載玻片上干燥5～15 min，酒精固定15 min，加30 μL單抗，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌干燥，添加二抗，37 ℃溫育30 min、干燥后鏡檢[5]。

1.1.2 動物接種或細(xì)胞培養(yǎng)法

取患者的待檢樣本接種于小鼠腹腔，培養(yǎng)1周后剖殺取腹腔液鏡檢，或?qū)颖窘臃N于離體培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)9 h，然后進(jìn)行鏡檢[6]。其優(yōu)點是比直接涂片染色觀察檢出率更高，但其耗時較長，同時可能具有擴(kuò)散病原體的風(fēng)險[5]。

1.2 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷方法是臨床實驗室診斷弓形蟲病的首選和最常用的診斷方法。在臨床中，對于孕婦妊娠期弓形蟲病的檢測，血清學(xué)方法具有重要意義[7-8]。通過對IgG親和力的測定可以更好地估計被感染的時間并確定妊娠期間是否發(fā)生原發(fā)性弓形蟲的感染[7]。這些方法是基于宿主弓形蟲特異性免疫球蛋白對弓形蟲表面抗原的識別。不同的血清學(xué)診斷方法常常檢測不同的抗體。感染弓形蟲后，抗體(Ig)相繼產(chǎn)生，抗體產(chǎn)生的動力學(xué)可能有助于確定感染的階段。感染后1周內(nèi)首次產(chǎn)生IgA和IgM，1個月內(nèi)滴度達(dá)到穩(wěn)定，1～6個月后下降。在某些個體中，IgM可在急性感染后很長時間內(nèi)被檢測到，所以IgM陽性結(jié)果可能提示急性、近期或過去感染[9]。此外有一些方法可以進(jìn)行輔助檢測，如特異性IgA檢測、IgG效價分析和IgG親和度檢測，以便更好地確定感染階段。不過，特異性IgA不能作為急性感染的替代標(biāo)志物。特異性IgG在感染開始后2～3個月內(nèi)達(dá)到一個平臺期，然后降低并保留持續(xù)終生的殘留滴度。IgG陽性結(jié)果提示既往感染，但不能準(zhǔn)確判斷感染的時間。

1.2.1 染色試驗(DT)

染色試驗是根據(jù)Sabin和Feldman的微量滴定技術(shù)進(jìn)行的經(jīng)典血清學(xué)方法，具有良好的特異性、敏感性和可重復(fù)性[10]。其原理是活動弓形蟲速殖子的細(xì)胞質(zhì)在接觸抗原抗體復(fù)合物時發(fā)生了改變，不能被甲藍(lán)染成藍(lán)色。當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時免疫血清(含特異性抗體)60%以上胞外速殖子呈未染及新月形正常的形態(tài)；當(dāng)檢測結(jié)果為陰性時(不含特異性抗體)，細(xì)胞外50%以上及細(xì)胞內(nèi)速殖子均表現(xiàn)為甲藍(lán)染色的深藍(lán)色，且呈圓形或卵圓形。在一項對婦女和綿羊、山羊中弓形蟲病診斷方法的對比研究[11]中顯示，DT法與ELISA IgG法、PCR法的檢測結(jié)果均無顯著差異(P>0.05)。但也有研究[12]顯示，在52個低濃度IgG(2～10 U·mL-1)樣本中用DT法檢測，3次均出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這表示DT法對低水平IgG結(jié)果的解釋還存在著一定的不足。

1.2.2 間接血凝試驗(IHA)

間接血凝試驗法是將抗原(或抗體)包被在紅細(xì)胞的表面，使其成為致敏的載體，之后與相應(yīng)的抗體(或抗原)結(jié)合，從而使紅細(xì)胞拉聚在一起，出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)。該法有較好的特異性和敏感性，配合試劑盒使用操作簡便，只需采取血液并離心得到血清樣本，在低溫條件下使用一定的稀釋度對樣本進(jìn)行滴度檢測即可。一項流行病學(xué)研究[13]使用IHA、間接免疫熒光試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗分別對不同的山羊群血清樣本進(jìn)行測試，結(jié)果顯示三者陽性和陰性結(jié)果一致指數(shù)均較高(97.7%)，此外，三者之間的相關(guān)性也很高。但也有研究[14]表明IHA要比改良凝集試驗(MAT)的檢測效果弱一些。

1.2.3 改良凝集試驗(MAT)

MAT是利用制備的弓形蟲整蟲抗原可以識別不同動物的抗體擴(kuò)大了可凝集的抗原抗體范圍的改良法，在血清中抗體和弓形蟲的速殖子表面上的抗原結(jié)合后才能夠發(fā)生交聯(lián)凝集反應(yīng)，有較好特異性，現(xiàn)在市場上已經(jīng)出現(xiàn)了商業(yè)化改良試劑盒，使用較簡便。在埃及的一項對綿羊的血清樣品進(jìn)行弓形蟲病血清學(xué)檢測的比較研究中[15]，MAT法的靈敏度可達(dá)96%，特異性達(dá)到88.9%。在巴西的一項針對山羊的弓形蟲病血清學(xué)比較研究中[16]，以間接免疫熒光法(IFA)為標(biāo)準(zhǔn)，ELISA和MAT也表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)囊恢滦?kappa=0.74和0.61)。CASARTELLI ALVES等[17]學(xué)者的一項評估不同實驗室診斷方法的研究顯示，MAT法的敏感性和特異性達(dá)到了76%和68%，是該項研究中效果最好的診斷方法。上述研究表明了MAT法具有較好的敏感性和特異性，與ELISA、IFA相比具有更短的耗時、更少的勞動力需求、更簡單的設(shè)備與操作和可以在任何物種的血清上進(jìn)行等優(yōu)點[18]。但若在具有高度溶血或脂質(zhì)的樣本中，MAT的陽性率可能會偏高[19]。

1.2.4 間接免疫熒光試驗(IFA)

IFA采用完整蟲體為抗原，以熒光標(biāo)記的第二抗體檢測特異性抗體，當(dāng)大多數(shù)固定的速殖子(>50%)在1:64和1:50稀釋時對弓形蟲有完全的外周熒光，血清樣本即被認(rèn)為是陽性的[20]。該檢測方法可測同型及亞型抗體，在新生兒先天性弓形蟲病感染的檢測中用其檢測IgM，對疾病早期診斷和判定具有較大意義。在SINGH等[21]的一項檢測家養(yǎng)反芻動物弓形蟲病抗體的研究中，基于重組SAG2抗原的ELISA法與IFA法相比，其檢測靈敏度在81.25%至87.10%，而特異性處于85.71%至91.43%，二者檢測結(jié)果顯示出了較高的一致性；通過IFA法發(fā)現(xiàn)111例(28.38%)血清陰性和280例(71.61%)血清陽性，通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)124例(33.70%)血清陰性，267例(68.28%)血清陽性，二者結(jié)果無顯著差異(P>0.05)，并且因其較高的準(zhǔn)確性及較為低廉的檢測費用，IFA法與ELISA法在臨床上應(yīng)用于孕婦產(chǎn)前檢測弓形蟲病上具有積極的意義。在CASARTELLI ALVES等[17]的對多項實驗室診斷方法檢測弓形蟲感染的對比研究中，IFA法的敏感性和特異性為80%和52%，雖略低于MAT但也顯示出了較好的檢測效果。但若在使用G蛋白非特異性結(jié)合抗體時，G蛋白與抗體的親和性差異也可能導(dǎo)致檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差[19]。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA法可用在檢測宿主的多種特異性抗體如IgG、IgM和IgA等，現(xiàn)已存在多種改良法廣泛用于先天性和早期急性感染弓形蟲病的診斷[6]。其基本操作方法是先將抗原或抗體結(jié)合到固相上，再加入特異性的抗體或抗原形成抗原-抗體結(jié)合物，然后使用酶標(biāo)記的抗原或抗體去結(jié)合從而達(dá)到檢測的目的[20]。在GHONEIM等[11]的一項研究中用ELISA(檢測IgM和IgG)和DT染色法對綿羊弓形蟲病進(jìn)行檢測，陽性率分別為98.4%和90.3%。在CASARTELLI ALVES等[17]的對多項實驗室弓形蟲診斷方法的對比研究中，ELASA法的敏感性和特異性分別為85%和56%，顯示出了較好的檢測效果。Singh和Sudan的兩項基于重組SAG2抗原的ELISA法檢測弓形蟲病的研究中，SINGH等[21]用來自綿羊、山羊和牛的168個現(xiàn)場血清樣品評估了重組蛋白的診斷潛力，并與IFA法進(jìn)行了對比，結(jié)果顯示recSAG2-ELISA的靈敏度為81.25%～87.10%，而特異性為85.71%～91.43%，具有較高的吻合性；SUDAN等[22]用258頭牛血清樣品評估了重組蛋白的診斷潛力，也與IFA法進(jìn)行了相比，recSAG2-ELISA的敏感性為80.00%，特異性為88.57%(CI=95%)，2次試驗之間基本吻合。在一項對孕婦弓形蟲病感染的研究中[6]，研究者使用了ELISA和IFA(針對IgG和IgM抗體)分別對孕婦的感染進(jìn)行了檢測，結(jié)果通過IFA發(fā)現(xiàn)111例(28.38%)血清陰性和280例(71.61%)血清陽性，通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)124例(33.70%)血清陰性，267例(68.28%)血清陽性，二者結(jié)果具有較好的一致性，且ELISA的效果優(yōu)于IFA。因其優(yōu)良的檢測性能與不復(fù)雜的檢測操作，當(dāng)高度懷疑感染及孕早期感染時，重復(fù)該血清學(xué)檢測和其他化驗方法進(jìn)行結(jié)果快速確認(rèn)在臨床上對患者的診斷具有重要意義[23]。以上研究表明，ELISA法對弓形蟲抗體的檢測具有較好的效果，但可能由于使用多物種結(jié)合物而被低估[19]。

2 分子診斷方法

目前血清學(xué)方法診斷仍存在一些無法解決的局限性，如無法確認(rèn)先天性傳播或免疫缺陷患者的胎兒和大腦中是否存在弓形蟲。分子診斷技術(shù)的使用，可有效避免對子宮內(nèi)胎兒采用侵入性的檢測方法，近十年來已開發(fā)出不同的分子檢測方法，包括傳統(tǒng)PCR、巢式PCR(nested PCR)、實時PCR(real-time PCR)以及循環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)等來檢測生物樣本中的弓形蟲基因[24]。未來隨著生物信息學(xué)與基因組學(xué)的進(jìn)步，將會有越來越多的靶向基因被發(fā)現(xiàn)，這又將促進(jìn)弓形蟲分子診斷的進(jìn)一步發(fā)展。

2.1 傳統(tǒng)PCR

在傳統(tǒng)PCR方法中，一個特定的基因組片段可以被擴(kuò)增放大，從而產(chǎn)生數(shù)百萬個目標(biāo)DNA分子。BURG等[25]最早建立了弓形蟲的PCR檢測技術(shù)，擴(kuò)增了弓形蟲基因組的35個重復(fù)B1基因。之后，18S rRNA-基因、P30-基因、b1-基因、529-bp重復(fù)片段和AF146527等多個多拷貝靶向基因被用于不同生物樣本中弓形蟲的檢測[26]。PCR技術(shù)已成功地使用腦組織、房水、玻璃體液和羊水、胎盤用于診斷先天性和眼部弓形蟲病，此外，全血、尿、腦脊液、胸膜和腹腔液也已被有效地用于診斷免疫缺陷患者所患的弓形蟲病。在埃及的一項對婦女弓形蟲病的檢測手段的對比研究中[11]，ELISA、DT和PCR的檢測結(jié)果之間無顯著差異(P>0.05)。在一項對野生鳥類的弓形蟲感染的研究中[27]，使用IFA和PCR對216只動物進(jìn)行了檢測，陽性率分別為11.6%和8.8%。這顯示了其與血清學(xué)診斷之間結(jié)果具有較好一致性。

2.2 巢式PCR

其可以用來增加DNA擴(kuò)增的特異性以檢測數(shù)量很少的病原體，并且可作為診斷不同弓形蟲病類型的一種有價值的、準(zhǔn)確的、特異的方法。此外，巢式PCR對河流、水井和海水中弓形蟲卵囊的檢測也具有較高的敏感性[28]。ALONSO等[29]的一項研究表明，巢式PCR是一種快速、靈敏、有效的檢測HIV患者弓形蟲病的分子診斷方法。

2.3 實時PCR

該方法是近年來發(fā)展起來的一種檢測方法，它對臨床樣本中的病原體具有較高的特異性和診斷準(zhǔn)確性，同時RT-PCR是檢測病原體較敏感的分子檢測方法，特別是在目標(biāo)DNA濃度較低時。RT-PCR較傳統(tǒng)PCR的主要優(yōu)點在于不需要打開反應(yīng)管，可以降低擴(kuò)增子遭受環(huán)境污染的風(fēng)險，減少假陽性結(jié)果，此外，RT-PCR檢測與傳統(tǒng)PCR相比還具有更快速、靈敏和可重復(fù)性的特點。WELLS等[30-31]的研究表明，RT-PCR方法具有較高敏感性，并且與其他分子生物學(xué)方法相比有較好一致性。

2.4 多重PCR

多重PCR可以聯(lián)合使用多個引物集進(jìn)行病原體的檢測，可以實行巢式多重PCR檢測和實時多重PCR檢測。HALLU等[32]設(shè)計了一個多重PCR方案，該P(yáng)CR包含靶向人β球蛋白基因的引物(可作為內(nèi)部對照)和2個針對B1基因和5s基因的引物，結(jié)果顯示該法靈敏度為83.3%，特異性為100%。RAHUMATULLAH等[33]也開發(fā)出一種針對B1基因和ITS-1區(qū)域的多重PCR，其在檢測中敏感性可達(dá)97.5%～99.9%，效率達(dá)97%～99%，能檢測到10 pg的弓形蟲DNA，104個體液中的速殖子。上述研究表明了多重PCR在弓形蟲檢測的敏感性和特異性較單一PCR具有一定優(yōu)勢，也提示在基因位點的選擇上仍存在較大發(fā)展空間。

2.5 循環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)

LAMP是一種改良的PCR方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高效、快速等優(yōu)點。該方法利用具有鏈沉降活性的DNA聚合酶(Bst)和4～6個特異性引物，在恒溫(60～65 ℃)條件下擴(kuò)增DNA，能識別目標(biāo)DNA中的6～8個不同區(qū)域[34]。LAMP與傳統(tǒng)PCR相比，具有不需要特別復(fù)雜的設(shè)備，不需要長耗時，不需要提取DNA，對血液、血清和食品配料等PCR抑制劑的耐受性更強(qiáng)的優(yōu)點[34]。在一項使用LAMP和巢式PCR檢測白血病兒童弓形蟲抗體的研究中[24]，在50份血清陽性樣本(IgM+，IgG+)中，獲得的陽性結(jié)果LAMP分別占92%和86%，巢式PCR分析分別占82%和68%，LAMP體現(xiàn)出了較高的準(zhǔn)確率。同時在對10倍稀釋的弓形蟲DNA進(jìn)行檢測時，LAMP在與巢式PCR的對比中顯示出了更高的靈敏度[26]。

3 診斷方法的聯(lián)合使用

診斷方法的聯(lián)合主要是血清學(xué)與分子技術(shù)的聯(lián)合診斷。聯(lián)合診斷可以提高檢測靈敏度、特異性和檢測效率，并且克服了現(xiàn)有手段的局限性，將兩種手段進(jìn)行優(yōu)勢互補(bǔ)以獲得更理想的診斷效果。

ELISA-PCR聯(lián)合診斷弓形蟲病，既提高了檢測范圍，又提高了準(zhǔn)確度，且在聯(lián)合檢測中可以縮短操作時間，比單一方法具有更好的分析性能。其操作為先用ELISA法對患者血清樣本進(jìn)行檢測，再對抗體陽性的患者取血樣進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增進(jìn)行檢測，進(jìn)一步分析有抗體親和性差異的結(jié)果[35]。一項對孕婦弓形蟲病的早期診斷研究[35]，從143名孕婦中收集血清，并用ELISA法檢測弓形蟲的IgM、IgA和IgG的親和力；從57個外周血和14個羊水樣本中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示使用ELISA檢測143名婦女中有57名血清反應(yīng)陽性，其中9名女性的IgG抗體親和力低，表明存在急性感染；3名婦女表現(xiàn)出中等親和力。用PCR檢測出了9名表現(xiàn)出低親和力女性存在弓形蟲DNA，而對于中等親和力病例則呈陰性。該結(jié)果顯示，與ELISA相結(jié)合的PCR檢測比單獨使用ELISA法具有更好的分析性能，也彌補(bǔ)了酶聯(lián)試驗在面對IgG親和力分析時的不足[35]。ROOZBEHANI等[36]研究了2120份孕婦血清樣本，發(fā)現(xiàn)結(jié)合PCR的酶聯(lián)熒光法與單獨進(jìn)行酶聯(lián)法在區(qū)分高、低風(fēng)險感染和減少孕婦不必要治療的頻率方面更加可靠，多重PCR結(jié)合血清學(xué)方法對高危妊娠的檢測和先天性弓形體病的診斷具有重要意義，可對IgM陽性或不明確的孕婦進(jìn)行進(jìn)一步明確的診斷，比單一抗體檢測提高了精準(zhǔn)性[37]。在檢測孕婦的原發(fā)性急性弓形蟲病中，聯(lián)合診斷存在定義和選擇母嬰傳染高危病例的可能[38]。MARTINEZ等[39]也開發(fā)出一種ELISA-PCR結(jié)合測定法用于弓形蟲的檢測，其與單一Southern blotting法相比具有操作更加簡便，用時更短等優(yōu)勢。

4 結(jié)語

幾十年來，對人弓形蟲病的檢測手段已經(jīng)有了長足的進(jìn)展。傳統(tǒng)的檢測手段有病原學(xué)和血清學(xué)診斷，病原學(xué)診斷方法簡單，且診斷結(jié)果具有確診意義，主要用于臨床急性感染的檢測，但因其檢出率不高，現(xiàn)已較少被采用；血清學(xué)檢查是目前實驗室診斷弓形蟲病的首選和最常用的診斷方法，方法上具有多樣性，準(zhǔn)確率也較高，許多商業(yè)化試劑盒對弓形蟲病的檢測帶來了極大的便利性。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，分子診斷的優(yōu)勢不斷體現(xiàn)，解決了血清學(xué)檢測的一些局限性，同時準(zhǔn)確性也較高，因此尋找更多有效的相關(guān)基因位點用于檢測可能是將來的研究方向。血清學(xué)、分子技術(shù)各有其優(yōu)勢和局限性，聯(lián)合診斷由于擴(kuò)展了檢測的深度與廣度，可能會是未來人弓形蟲病診斷技術(shù)發(fā)展的趨勢。