呂東霞，禹 瑞，屈戰(zhàn)果，范明松*

（1.鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校，河南鄭州 450064；2.上海雷允上藥業(yè)有限公司，上海 201401）

芒果苷是芒果葉主要活性成分之一,也可從知母中提取得到［1］,具有抗糖尿病及其并發(fā)癥、調(diào)節(jié)脂代謝、抗腫瘤、心血管保護等多種藥理作用［2-4］,應用前景廣闊,具有一定研發(fā)價值,但該成分口服吸收生物利用度僅為1.2%［5］,導致其藥效發(fā)揮大打折扣。納米技術在提高藥物生物利用度方面的作用得到了醫(yī)藥工作者的公認,目前已有采用自微乳提高芒果苷生物利用度的報道［6］,但該方法需使用大量表面活性劑,存在溶血等風險［7］,故開發(fā)一種安全性較高的納米給藥系統(tǒng)具有重要意義。

如今,對固體脂質(zhì)納米粒［8-11］的研究較多,技術也較為成熟,該方法采用生理相容性良好的載體材料將藥物包裹于其中,從而起到改變藥動學、促進吸收、提高生物利用度的目的,而且表面活性劑用量遠低于自微乳。因此,本實驗制備芒果苷固體脂質(zhì)納米粒,并對其體內(nèi)藥動學進行考察,以期為其他相關制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀,配置二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；TM-14SB型集熱式磁力攪拌器 （上海沉匯儀器有限公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；MD200-5型氮氣吹掃儀（杭州奧威儀器有限公司）；AllegraTMX-22R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；H-7650型透射電鏡（日本日立公司）；MixMax型渦旋混合器（合肥艾本森科研儀器有限公司）；Master-sizer型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

芒果苷原料藥（批號110331,純度＞98%,天津市中新藥業(yè)有限公司）；芒果苷對照品（批號111558-201608,純度99.2%,中國食品藥品檢定研究院）；大豆卵磷脂（批號PC-98T,上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯 （批號161025,北京鳳禮商貿(mào)有限公司）；超濾離心管（30 kDa,美國Millipore公司）；泊洛沙姆188（WPEE587E,德國巴斯夫公司）。其他試劑均為分析純。

SD大鼠,體質(zhì)量（300±20）g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 芒果苷含有量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相甲醇-0.1% 磷酸（40 ∶60）；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長258 nm。

2.1.2 線性關系考察 將10 mg芒果苷對照品溶于100 mL甲醇中,得到100 μg/mL貯備液,甲醇依次稀釋至20.0、5.0、1.0、0.1、0.05 μg/mL,作為對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行回歸,得方程為Y=30.115 8X+5.217 4 （r=0.999 8）,在0.05～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 取 “2.1.2” 項下20.0、5.0、0.05 μg/mL對照品溶液適量,在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次,測得芒果苷峰面積RSD分別為0.12%、0.24%、0.18%,表明儀器精密度良好。取1 mL納米混懸液至10 mL量瓶中,加入5 mL甲醇超聲提取后流動相定容至刻度,過0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液,平行制備6份,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷峰面積RSD為1.38%,表明該方法重復性良好。取同一份供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷峰面積RSD為0.72%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取1.0 mL空白固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐?0 mL量瓶中,共9份,加入“2.1.2” 項下100 μg/mL對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL各3份,再加入5 mL甲醇超聲提取后流動相定容至刻度,過0.45 μm微孔濾膜,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷平均加樣回收率為99.31%,RSD為1.78%。

2.2 芒果苷固體脂質(zhì)納米粒制備 參考文獻［8］報道的方法。取芒果苷10 mg、大豆磷脂30 mg、單硬脂酸甘油酯200 mg,置于10 mL無水乙醇中,70 ℃水浴溶解,作為油相；配制30 mL 0.5%泊洛沙姆188溶液,置于70 ℃水浴中加熱,作為水相,在800 r/min攪拌速度下將油相滴加到水相中,繼續(xù)攪拌3 h后超聲（200 W）提取10 min （每提取3 s,間隔2 s）,低溫固化,過0.45 μm微孔濾膜,0.5%SDS溶液補充體積至30 mL,即得。同法制備空白納米?；鞈乙?。

2.3 包封率、載藥量測定 取1 mL芒果苷固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐?5 mL量瓶中,加入15 mL甲醇超聲提取后流動相定容至刻度,過0.45 μm微孔濾膜,平行3份,HPLC法測得芒果苷平均總質(zhì)量為332.86 μg；取納米粒混懸液1 mL,置于超濾管中,12 000 r/min離心30 min,合并濾液,取1 mL至5 mL量瓶中,平行3份,HPLC法測得游離芒果苷平均質(zhì)量為64.54 μg。按照文獻［8］報道的方法測定包封率、載藥量,測得3批納米粒平均包封率為80.61%,載藥量為3.16%。

2.4 形態(tài)觀察 取芒果苷固體脂質(zhì)納米?；鞈乙哼m量,蒸餾水稀釋50倍后滴加于銅網(wǎng)上,自然干燥,2%磷鎢酸染色6 min后置于透射電鏡（TEM）下觀察其形態(tài),結(jié)果見圖1。由此可知,納米粒呈類球形或橢圓形,粒子之間無粘連。

圖1 納米粒TEM圖Fig.1 TEM image for nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta電位測定 取3批芒果苷固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?蒸餾水稀釋50倍后測定其粒徑、Zeta電位,結(jié)果見圖2～3。由此可知,納米粒平均粒徑為178.63 nm,PDI為 0.083,Zeta電位為-18.2 mV。

圖2 納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of nanoparticles

圖3 納米粒Zeta電位Fig.3 Zeta potential of nanoparticles

2.6 凍干粉制備 為了增加芒果苷固體脂質(zhì)納米粒穩(wěn)定性,并便于大鼠灌胃給藥,本實驗將其進一步制成凍干粉。在納米?；鞈乙褐屑尤?%乳糖后混勻,分裝于2 mL西林瓶中,置于-60 ℃超低溫冰箱中預凍2 d后迅速冷凍干燥2 d （15 Pa、-20 ℃）,緩慢升溫至25 ℃并保持2 h,即得（芒果苷質(zhì)量分數(shù)為0.578%）。

2.7 體外釋藥 采用透析袋法。以900 mL水（pH 1.2）為釋放介質(zhì)［12］,設定溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為75 r/min,取適量芒果苷固體脂質(zhì)納米粒凍干粉至3 mL釋藥介質(zhì)中 （以芒果苷計質(zhì)量為20 mg）,以3 mL含相同原料藥的甲醇為對照,置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da）,于0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36 h各取樣2 mL,并自動補加2 mL空白溶出介質(zhì),經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,繪制體外釋藥曲線,見圖4,可知原料藥在4 h內(nèi)基本釋放完全,而納米粒在前4 h屬于快速釋藥期,4 h后屬于緩慢釋藥期。再分別采用零級、一級、Higuchi、Weibull模型對納米粒體外釋藥進行擬合,結(jié)果見表1,可知其更符合Weibull模型。

圖4 芒果苷體外釋藥曲線Fig.4 In vitrodrug release curves for mangiferin

表1 模型擬合結(jié)果Tab.1 Results of model fitting

2.8 體內(nèi)藥動學研究

2.8.1 分組、給藥及采血 12只大鼠隨機分為2組,每組6只,給藥前禁食12 h,自由飲水。將芒果苷及其固體脂質(zhì)納米粒凍干粉分別用0.5%CMCNa溶液和純化水制成2 mg/mL混懸液,灌胃給予2組大鼠,給藥劑量均為20 mg/kg （以芒果苷計）,于0.167、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶采血,3 500 r/min離心3 min后取上層血漿,低溫保存。

2.8.2 血漿樣品處理 將10 mg葛根素對照品溶于50 mL甲醇中,甲醇稀釋至200 ng/mL,即得內(nèi)標溶液。取“2.8.1” 項下血漿樣品100 μL,加入內(nèi)標溶液20 μL、甲醇1.0 mL,渦旋混合沉降蛋白,10 000 r/min離心15 min后取上層有機相,氮氣吹除有機溶劑,加入100 μL甲醇復溶,置于帶有內(nèi)襯管的液相瓶中。

2.8.3 線性關系考察 取 “2.1.2” 項下20.0 μg/mL對照品溶液,甲醇依次稀釋至2 000、1 000、500、250、100、20 ng/mL,各取100 μL,氮氣吹干后加入100 μL空白血漿,作為血漿對照品溶液,混勻,按 “2.8.2” 項下方法處理,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X）,芒果苷、內(nèi)標峰面積比值為縱坐標 （Y）進行回歸,得方程為Y=0.240 9X+0.084 2 （r=0.992 9）,在20～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.8.4 專屬性試驗 取血漿對照品（20 ng/mL）（按“2.8.3” 項下方法制備）+內(nèi)標、給藥12 h后血漿+內(nèi)標、空白血漿溶液,按“2.8.2” 項下方法處理,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,結(jié)果見圖5。由此可知,芒果苷與內(nèi)標分離度良好,血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

2.8.5 方法學考察 取 “2.8.3” 項下20、1 000、2 000 ng/mL對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6次,測得芒果苷、內(nèi)標峰面積比值RSD分別為8.67、3.06%、4.14%,表明儀器精密度良好。另取上述3個質(zhì)量濃度對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得加樣回收率在85.11%～92.39%之間。取含藥血漿樣品溶液適量,室溫下于0、2、6、12、18、24 h在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷、內(nèi)標峰面積比值RSD為8.17%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取不含內(nèi)標的對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,以S/N約為10為定量限,約為3為檢測限,測得兩者分別為5.0、2.0 ng/mL。

2.8.6 分析結(jié)果 采用3P97程序統(tǒng)計矩模型計算主要藥動學參數(shù),結(jié)果見表2,血藥濃度-時間曲線見圖6。由此可知,納米粒tmax、 Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料藥（P＜0.01）,相對生物利用度提高至216.69%。

圖5 芒果苷HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of mangiferin

表2 芒果苷主要藥動學參數(shù)（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for mangiferin（， n=6）

表2 芒果苷主要藥動學參數(shù)（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for mangiferin（， n=6）

注：與芒果苷比較,**P＜0.01。

圖6 芒果苷血藥濃度-時間曲線Fig.6 Plasma concentration-time curves for mangiferin

3 討論

本實驗制備芒果苷固體脂質(zhì)納米粒時,采用磷脂、單硬脂酸甘油酯作為混合載體,可防止藥物被排擠出晶格,有助于增加其包封率、穩(wěn)定性等［8,13］。張杰等［14］研究認為,在制備有機相時磷脂可能會與藥物形成一種親脂的藥物-磷脂復合物［15-16］,可增加藥物與載體的相容性［17］,從而提高其包封率；文獻［18］報道,聯(lián)合使用乳化劑有利于提高穩(wěn)定性,降低納米制劑粒徑；本實驗所用的泊洛沙姆188可提供空間位阻,防止納米粒聚集,并且磷脂可能也會起到降低油水界面張力、提高乳化效率的作用。綜上所述,磷脂在固體脂質(zhì)納米粒處方中具有多重作用。

芒果苷水溶性、脂溶性均較差［14］,從而影響了該成分溶出及透膜吸收,而且胃腸道菌群也會影響其穩(wěn)定性［12,19］,導致其吸收生物利用度不理想。固體脂質(zhì)納米粒可顯著增加芒果苷口服吸收,其原因可能為①納米制劑可增加藥物與胃腸道黏膜的接觸幾率,有助于其經(jīng)胞間、淋巴轉(zhuǎn)運等途徑吸收；②將芒果苷包裹進納米粒后可減少與各種酶的接觸,從而起到保護作用；③處方中磷脂的存在有助于增加胃腸道滲透性［20］,增加納米粒與胃腸道的生物黏附性［21-22］,最終增加藥物被吸收進入血液循環(huán)的幾率。