楊凌鑒 任莉莉 黃九林張勝海金華峰謝娟平賈 璞鄭曉暉*

（1.安康學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，陜西安康 725000；2.安康學(xué)院秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西安康 725000；3.安康學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西安康 725000；4.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069）

香丹注射液是將丹參水提物和降香飽和芳香水按照一定比例混合精制而成的現(xiàn)代中藥制劑,屬于國(guó)家部頒標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-3289-98）收載的藥物［1-3］?，F(xiàn)代研究［4-7］顯示,該制劑具有擴(kuò)張血管、增強(qiáng)冠脈血流量等作用,能有效干預(yù)心肌缺血、腦缺血、機(jī)體缺氧,臨床上廣泛應(yīng)用于冠心病、心絞痛、心肌梗死以及腦血管疾病的治療,療效顯著確切。

中藥療效的發(fā)揮是多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果,故開(kāi)展多成分含有量測(cè)定有利于中藥材及其相關(guān)制劑的全面質(zhì)量控制［8-9］。前期報(bào)道,香丹注射液中丹參所含的酚酸是與該制劑臨床療效密切相關(guān)的主要活性物質(zhì)［10-11］,但目前其質(zhì)量控制方法主要是選擇丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A中的幾種［2-3,12］或全部［10-11］進(jìn)行定量分析,未涉及原兒茶酸、香草酸,而且檢測(cè)波長(zhǎng)均設(shè)置為280 nm,可能會(huì)影響部分成分的檢測(cè)靈敏度。因此,本實(shí)驗(yàn)在前期采用HPLC-Q-TOF/MS法對(duì)香丹注射液化學(xué)成分進(jìn)行定性分析的基礎(chǔ)上［13］,建立HPLC法同時(shí)測(cè)定該制劑中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的含有量,以期為其質(zhì)量控制的完善提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀,配置G1312C二元泵、G1328B手動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測(cè)器、Chemstation 5.0化學(xué)工作站 （美國(guó)Agilent公司）；MS105DU型電子天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ULUP-I-10型超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；QL-901型快速混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A對(duì)照品 （批號(hào)分別為DST180302-014、DST180428-081、DST180105-011、DST180311-088、DST181018-013、DST170524-028、DST180105-027、DST180128-009、DST180201-008）,均購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司,純度均大于98%。香丹注射液（批號(hào)1510201、1510202、1510203,國(guó)藥準(zhǔn)字Z51021309,10 mL×5支）,購(gòu)于四川升和藥業(yè)股份有限公司；色譜純甲醇 （德國(guó)Merck公司）；色譜純甲酸（美國(guó)Sigma Aldrich公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（電阻率18.25 MΩ）,由優(yōu)普ULUP-I-10超純水機(jī)系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動(dòng)相0.2% 甲酸水 （A）-甲醇（B）,梯度洗脫（0～25 min,7%～15% B；25～45 min,15%～25% B；45～80 min,25%～50%B；80～100 min,50%～80% B）；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm （0～46、58～100 min,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A）、260 nm （46～52 min,香草酸）、320 nm （52～58 min,咖啡酸）；進(jìn)樣量25 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A對(duì)照品適量,置于2.0 mL棕色量瓶中,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛用50%甲醇定容,其余對(duì)照品用甲醇定容,制得質(zhì)量濃度分別為8.00、3.20、2.40、2.60、2.00、3.00、2.80、5.20、2.20 mg/mL的貯備液,分別精密移取0.5 mL,甲醇稀釋,即得（444.00、178.00、133.00、144.00、111.00、167.00、156.00、289.00、122.00 μg/mL）,在4 ℃下冷藏備用。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取注射液1.0 mL,置于5.0 mL棕色量瓶中,超純水定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾,即得,在4 ℃下冷藏備用。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例和工藝流程,制備缺丹參的陰性樣品,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備,即得,在4 ℃下冷藏備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各25 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知,各成分色譜峰與相鄰峰均達(dá)到基線分離,理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均大于5 000,陰性無(wú)干擾,表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 將“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液用甲醇依次稀釋至系列質(zhì)量濃度,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸,分別以S/N=3、S/N=10為檢測(cè)限、定量限,結(jié)果見(jiàn)表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A峰面積RSD分別為0.79%、0.91%、1.60%、0.92%、1.18%、1.39%、0.98%、1.07%、1.40%,表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批注射液 （批號(hào)1510203）,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A含有量RSD分別為0.92%、2.30%、1.78%、1.98%、0.87%、1.06%、0.76%、0.51%、2.28%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批注射液（批號(hào)1510203）,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于 0、2、4、8、12、24 h,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A峰面積RSD分別為0.50%、1.99%、1.04%、0.99%、1.12%、1.82%、0.56%、0.60%、1.47%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取各成分含有量已知的注射液（批號(hào)為1510203）0.5 mL,置于5 mL棕色量瓶中,按100% 水平加入對(duì)照品溶液0.5 mL （丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A質(zhì)量濃度分別為1 510.20、6.15、385.61、3.92、8.09、176.38、325.95、696.46、52.54 μg/mL）,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A平均加樣回收率分別為100.83%、101.28%、103.14%、98.45%、97.79%、100.31%、99.54%、96.52%、102.69%,RSD分別為2.48%、2.27%、0.97%、1.32%、1.12%、1.79%、1.31%、1.04%、0.88%。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4 樣品含有量測(cè)定 取3批香丹注射液,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批平行3份,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算含有量,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（μg/mL， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （μg/mL， n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)篩選 研究表明,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A具有抗心腦缺血、抑制血小板聚集、抗炎、保肝腎、抗氧化等多種顯著藥理活性［14-15］。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇上述9種酚酸類成分作為檢測(cè)指標(biāo)。

3.2 色譜條件篩選 在前期研究中,已對(duì)流動(dòng)相種類、洗脫方式、柱溫等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化［13］,故本實(shí)驗(yàn)僅需考慮水相添加劑和檢測(cè)波長(zhǎng)即可。所檢測(cè)的成分均為酚酸類,常用的水相添加劑有甲酸、乙酸［16-17］,本實(shí)驗(yàn)對(duì)其種類和加入量進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)0.2%甲酸水洗脫時(shí)各成分峰形最好,色譜峰不拖尾。另外,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A在280 nm波長(zhǎng)處有最大紫外吸收［18］,而香草酸、咖啡酸分別在260 nm［19］、322 nm［20］波長(zhǎng)處有最大紫外吸收,為了確保各成分均具有最佳的檢測(cè)靈敏度,本實(shí)驗(yàn)采用分時(shí)間段變換波長(zhǎng)模式進(jìn)行分析。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定香丹注射液中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的含有量,該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,穩(wěn)定可靠,可為該制劑質(zhì)量控制的完善提供參考依據(jù)。