曹穩(wěn)根，李梅梅，王 晴，段 紅，翟科峰

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

王棗子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan為唇形科香茶菜屬多年生草本植物,是該屬少有的藥食兩用植物,主要分布于安徽省宿州市埇橋區(qū)夾溝鎮(zhèn)等山區(qū),是宿州當(dāng)?shù)赜忻膫鹘y(tǒng)草藥,民間常用于治療瘡癤、惡瘡、腫瘤、肺結(jié)核、肺膿瘍、老慢支等多種疾病,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血栓、抗癌等藥理作用［1-6］。大量研究表明,黃酮具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗菌、抗病毒、抗癌、防治糖尿病腎病等多種藥理活性［7-21］,越來越受到廣泛關(guān)注,雖然王棗子莖葉中也含有豐富的該類成分［3,6］,但尚無關(guān)于其提取工藝的報(bào)道。

因此,本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶-超聲輔助提取王棗子葉總黃酮,不僅能縮短提取時(shí)間,還可大大提高總黃酮提取率,同時(shí)優(yōu)化該工藝,評(píng)價(jià)該成分抗氧化活性,以期為該藥材開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

HK-04A 200 g型手提式粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；U-3310型紫外分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；XO-250型超聲波細(xì)胞粉碎儀（南京先歐儀器制造有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦瀘西儀器廠）；PH酸度計(jì)（德國賽多利斯公司）。蘆丁對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)100080-201408）；纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司,活性50 U/mg）；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH,批號(hào)W3008E46572,美國Sigma公司）；其他試劑均為分析純。王棗子葉購自宿州綠源中醫(yī)藥科技有限公司,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周建理教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材預(yù)處理 將新鮮王棗子葉置于55 ℃烘箱中干燥2 h,控制其含水量在5% 以內(nèi),粉碎后過80目篩,裝入干燥磨口瓶中備用。

2.2 總黃酮提取液制備 精密稱取0.5 g “2.1”項(xiàng)下預(yù)處理藥材,加入50倍量2%纖維素酶溶液,50 ℃下酶解6 h后在75 ℃熱水中滅酶10 min［25］,冷卻濃縮至粘稠狀,按一定乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間進(jìn)行處理,濾液定容至100 mL量瓶中,即得。

2.3 總黃酮含有量測定

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品0.013 7 g,80%乙醇完全溶解后定容于25 mL量瓶中,得到0.548 mg/mL對(duì)照品溶液,精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL至25 mL比色管中,80%乙醇定容至10 mL,加入0.7 mL 5%亞硝酸鈉溶液反應(yīng)6 min,加入0.7 mL 10%硝酸鋁溶液搖勻后靜止6 min,再加入5 mL 10%氫氧化鈉溶液混合均勻,80% 乙醇定容至25 mL,靜置15 min,于510 nm波長處測定吸光度,平行3次,取平均值。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸,得方程為A=11.134 0X+0.005 2 （r=0.999 8）,在0～0.12 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 得率測定 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下提取液1 mL,按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定吸光度,平行3次,取平均值,計(jì)算總黃酮得率,公式為得率=（總黃酮質(zhì)量濃度×提取液體積/預(yù)處理藥材質(zhì)量）×100%,預(yù)處理藥材取自“2.1” 項(xiàng)下。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL,按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定6次吸光度,測得其RSD為0.84%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批“2.1” 項(xiàng)下預(yù)處理藥材6份,每份0.5 g,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備提取液,各精密吸取1 mL,按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定吸光度,測得其RSD為1.12%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批“2.1” 項(xiàng)下預(yù)處理藥材6份,每份0.5 g,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備提取液,各精密吸取1 mL,按“2.3.1” 項(xiàng)下方法每隔15 min測定吸光度1次,持續(xù)120 min,測得其RSD為1.21%,表明溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批“2.1”項(xiàng)下預(yù)處理藥材6份,每份0.50 g,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備提取液,各精密吸取1 mL,置于25 mL比色管中,精密加入對(duì)照品溶液1 mL,按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定吸光度,測得總黃酮平均加樣回收率為98.90%,RSD為1.19%。

2.4 單因素試驗(yàn) 圖1A顯示,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,總黃酮得率先升后降,在60% 時(shí)達(dá)到最大值13.96%；圖1B顯示,隨著“2.1” 項(xiàng)下預(yù)處理藥材料液比的增加,總黃酮得率先升后降,在1 ∶40時(shí)達(dá)到最大值15.07%；圖1C顯示,隨著超聲功率增加,總黃酮得率先升后降,在125 W時(shí)達(dá)到最大值13.63%；圖1D顯示,隨著提取時(shí)間延長,總黃酮得率先升后降,在16 min時(shí)達(dá)到最大值為13.94%。因此,確定最佳單因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,料液比1 ∶40,超聲功率125 W,提取時(shí)間16 min。

2.5 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲功率（C）、超聲時(shí)間（D）作為影響因素,總黃酮得率（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用4因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,因素水平見表1,結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到二次多元回歸方程為Y=14.24 +0.002 5A-0.068B+0.14C-0.055D+0.090AB+0.37AC-0.10AD-0.21BC+0.21CD-0.63A2-0.32 B2-0.49C2-0.31D2,方差分析見表3。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由此可知,模型P＜0.01,表明模型極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05,表明模型擬合程度良好；變異系數(shù)為1.76%,表明模型精確度良好；信噪比＞4,表明模型可用于分析和預(yù)測；因素AC、 A2、 B2、C2、 D2具有顯著影響（P＜0.01）；各因素影響程度依次為超聲功率（C）＞料液比（B）＞超聲時(shí)間（D）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）。

響應(yīng)面分析見圖2～3。由此可知,超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用最強(qiáng),曲線陡峭,等高線呈橢圓形,對(duì)提取工藝有顯著影響；超聲功率與料液比、超聲功率與超聲時(shí)間交互作用次之,曲線較陡峭,等高線呈橢圓形,對(duì)提取工藝有一定影響；乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間交互作用較小,曲線平緩,等高線呈近圓形,對(duì)提取工藝無明顯影響。

圖2 各因素響應(yīng)面圖（三維曲面圖）Fig.2 Response surface plots for various factors （three-dimensional surface plots）

圖3 各因素響應(yīng)面圖（等高線圖）Fig.3 Response surface plots for various factors （contour plots）

通過Design-Expert軟件,得到最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%,料液比1 ∶ 39,超聲時(shí)間16 min,超聲功率130 W,總黃酮得率為13.96%。再按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn),測得總黃酮得率為13.92%,與預(yù)測值13.96% 接近,表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 對(duì)DPPH·的清除作用 按文獻(xiàn)［22］報(bào)道的方法,取5支具塞試管,加入0.1 mmol/L DPPH溶液各3 mL,再加入“2.2” 項(xiàng)下提取液各3 mL,搖勻后靜置30 min,以無水乙醇調(diào)零,在517 nm波長處測定吸光度Ai；取無水乙醇、提取液各3 mL,混合后在517 nm波長處測定吸光度Aj；取無水乙醇、DPPH溶液各3 mL,混合后在517 nm波長處測定吸光度A0,平行3次,計(jì)算清除率,公式為清除率=［1-（Ai-Aj）/A0］×100%。

體系中的抗氧化物質(zhì)通過提供電子與DPPH·的配對(duì)作用來使其褪色,依據(jù)其程度可以衡量清除活性強(qiáng)弱［22］。圖4顯示,對(duì)DPPH·的清除作用與總黃酮質(zhì)量濃度呈正相關(guān),在0.25 mg/mL時(shí)清除率達(dá)93.55%。

圖4 總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of total flavonoids on DPPH·

2.6.2 對(duì)·OH的清除作用 按文獻(xiàn)［23］報(bào)道的方法,取5支具塞試管,加入“2.2” 項(xiàng)下提取液各2 mL,再依次加入6 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL、1.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、0.1%H2O2溶液0.5 mL,在37 ℃下反應(yīng)15 min,在510 nm波長處測定吸光度Ax；以蒸餾水代替H2O2溶液,同法測定吸光度Ax0；以蒸餾水代替提取液,同法測定吸光度為A0,平行3次,計(jì)算清除率,公式為清除率=。

過氧化氫廣泛存在于生物體和食物中,根據(jù)Fenton反應(yīng)原理,當(dāng)遇到還原性金屬離子（Fe2+）時(shí)會(huì)釋放出氧化能力很強(qiáng)的羥自由基（·OH）,水楊酸可與其反應(yīng)生成有色物質(zhì),而當(dāng)反應(yīng)體系中含有能清除·OH的成分時(shí),就會(huì)與水楊酸產(chǎn)生競爭作用,使有色產(chǎn)物生成量減少［22-23］。圖5顯示,隨著總黃酮質(zhì)量濃度升高,對(duì)·OH的清除作用不斷增強(qiáng),在0.07～0.09 mg/mL范圍內(nèi)更明顯,其中在0.09 mg/mL時(shí)清除率達(dá)88%。

3 討論

圖5 總黃酮對(duì)·OH的清除作用Fig.5 Scavenging effect of total flavonoids on ·OH

響應(yīng)面法以多元二次回歸方程為函數(shù)估算工具,通過對(duì)回歸方程進(jìn)行分析來優(yōu)化工藝參數(shù),具有操作簡便、預(yù)測準(zhǔn)確的特點(diǎn)［24］。纖維素酶可破壞藥用植物細(xì)胞壁,改善細(xì)胞壁通透性,促進(jìn)黃酮內(nèi)容物溶出,具有作用條件溫和、耗時(shí)長等特點(diǎn)。超聲提取利用其空化效應(yīng)和攪拌作用來破壞植物細(xì)胞壁,具有時(shí)間短、節(jié)省溶劑等特點(diǎn)［25-26］。

本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶-超聲輔助提取王棗子葉總黃酮,得到最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%,料液比1 ∶39,超聲功率130 W,超聲時(shí)間16 min,總黃酮得率為13.92%?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,王棗子葉總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān),在0.25 mg/mL時(shí)清除率達(dá)93.55%,而在0.09 mg/mL時(shí)對(duì)·OH的清除率達(dá)88%。由此可知,該方法穩(wěn)定可靠,所提取的王棗子葉總黃酮不僅含有量高,而且抗氧化活性也較強(qiáng),應(yīng)用前景廣闊。