張 波，張 杰，張 顏，梁 燕

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

番茄(SolanumlycopersicumL.)是世界上栽培和消費最廣泛的蔬菜作物之一。在番茄生產過程中，花期調控與果實發(fā)育至關重要，其與產量、熟性等密切相關。赤霉素(GA)是一類重要的植物激素，其在植物開花誘導和果實發(fā)育過程起著重要作用[1-4]。

隨著GA信號轉導途徑中幾個關鍵調控因子的鑒定和功能分析，人們對GA調控植物生長發(fā)育的分子機制有了較為深入的認識[5-8]。GID1(GIBBERELLIN-INSENSITIVE DWARF1)是GA的受體，其能感知GA信號；DELLA蛋白屬于GA信號和植物生長發(fā)育的關鍵抑制因子，而GA促進植物的生長發(fā)育是通過降解DELLA蛋白來完成的[9]。在GA信號傳導途徑中，具有生物活性的GA首先結合GID1受體，然后與DELLA蛋白相互作用，形成GA-GID1-DELLA三元復合體[9-11]，最后該復合體通過泛素化途徑使DELLA蛋白發(fā)生水解，消除DELLA的抑制作用，并誘導DELLA下游基因的表達，進而調控植物生長發(fā)育[12-16]。例如，DELLA蛋白在植物成花過程中會抑制一些開花誘導基因的表達，而GA促使其快速降解，最終促成花轉變[17-20]。

GAMYB是GA信號途徑中的正向調節(jié)因子，屬于DELLA蛋白的下游基因。GAMYB最初是從大麥糊粉層中分離出來的，可以誘導許多GA響應基因的表達[21-23]。近年來，多項研究表明GAMYB在GA調控植物花發(fā)育的過程中起著關鍵作用[1]。例如，毒麥LtGAMYB主要在莖尖表達，其轉錄水平在開花誘導期間與GA含量同時上調，表明GA可能通過GAMYB的轉錄調控來誘導植物開花[24]。擬南芥中有3個GAMYB基因：AtMYB33、AtMYB65和AtMYB101[24-25]。擬南芥從短日照條件轉移到長日照條件或在短日照下經外源GA處理均誘導開花，與此同時，AtMYB33和花分生組織屬性基因LEAFY(LFY)在莖尖的表達水平上升，且AtMYB33的表達模式與LFY在莖尖重疊，但表達時間先于LFY[26-27]。此外，AtMYB33可以與LFY啟動子中一個特定的8-bp序列結合[28]，表明GAMYB可通過LFY基因的轉錄激活調控植物開花[28-29]。

目前，雖然GAMYB在調控植物開花方面的功能研究已取得了較大進展[8,30-37]，但其在番茄中的功能尚不清楚。另外，GAMYB調控果實發(fā)育的研究較少，難以理解其在GA調控果實發(fā)育中的作用和機制。筆者實驗室鑒定了番茄中的一個GAMYB同源基因SlMYB33，并進行了初步分析，SlMYB33基因定位在6號染色體上，包含3個外顯子和2個內含子，CDS序列全長1515bp，編碼504個氨基酸。SlMYB33氨基酸序列中包含1個R2R3重復序列和2個GAMYB家族特有的保守元件，證明SlMYB33屬于GAMYB家族，但對其功能的探討還非常有限。本研究在前期工作的基礎上，首先通過GUS組織化學染色對SlMYB33的表達進行分析；其次通過該基因在番茄中的過量表達分析其生物學功能，旨在了解GAMYB家族在番茄中是否具有保守或特異的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 以西北農林科技大學園藝學院番茄育種課題組保存的Micro-Tom和哥倫比亞生態(tài)型(Col)擬南芥為研究材料。Micro-Tom種植在組培室內，白天25 ℃，夜間18 ℃；擬南芥Col種植在光照培養(yǎng)箱內，白天22 ℃，夜間 16 ℃；光周期為光照16 h/黑暗8 h。

1.2 方 法

1.2.1 GUS組織化學染色 克隆SlMYB33的啟動子序列，將其替換pBI121載體的35S啟動子，構建pSlMYB33∶GUS融合表達載體。利用蘸花法將融合載體轉入到擬南芥Col中[38]，經PCR鑒定獲得陽性植株。選取轉基因植株的花序，置于X-Glu溶液中染色過夜(37 ℃、避光)，然后在脫色液(乙醇和乙酸體積比為 3∶1)中脫色約3 h，其間適時更換脫色液。脫色之后在體視顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.2 過量表達載體構建 過表達載體選擇的是pCAMBIA2307載體。用限制性內切酶XbaⅠ和KpnⅠ對pCAMBIA2307載體以及pMD18-T-SlMYB33進行雙酶切，回收目的片段，用T4連接酶連接載體片段和回收基因片段，連接過夜后轉入DH5α中，37 ℃培養(yǎng)，挑取單斑，進行菌落PCR，選擇符合目的條帶的菌液進行測序。

1.2.3 番茄遺傳轉化 將構建好的SlMYB33過表達載體通過電擊法轉入農桿菌，然后利用筆者課題組已建立的番茄遺傳轉化體系進行轉化：農桿菌侵染5 min，共培養(yǎng)1.5～2.0 d，通過抗生素和分化培養(yǎng)基進行陽性芽篩選，3～4 d后長出2～5 mm的不定芽移栽生根培養(yǎng)基，之后進行煉苗得到轉基因植株。分化培養(yǎng)基：MS + ZT(2 mg/L) + Kan (50 mg/L) + IAA (0.2 mg/L) +6-BA(2 mg/L) + CB (400 mg/L)；生根培養(yǎng)基：1/2 MS + IAA (0.2 mg/L)。

2 結果與分析

2.1 SlMYB33在花和果實中的表達特征分析

為預測SlMYB33基因的生物學功能，首先對其表達特征進行分析。構建 pSlMYB33∶GUS融合表達載體并轉入擬南芥中，然后利用GUS組織化學染色觀察該基因在花和果實中的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)(圖1)，與對照相比轉基因植株的雄蕊和柱頭被染成藍色，說明SlMYB33主要在雄蕊和柱頭中表達。

A. SlMYB33在野生型擬南芥中的GUS組織化學分析；標尺=2 mm，下同；B. SlMYB33在轉基因擬南芥中的GUS組織化學分析

2.2 SlMYB33過表達載體的構建

提取番茄花的RNA，反轉錄成cDNA后作為模板，用設計好的引物對其進行PCR擴增，PCR產物經回收、連接、轉化后進行菌落PCR檢測和雙酶切驗證。菌液1～5的PCR擴增條帶與陽性對照一致，均為1 500 bp左右(圖2-A)；雙酶切結果顯示，重組質?？杀幻盖谐? 500 bp和 6 000 bp的條帶，其中1 500 bp為目的基因長度(圖2-B)。最后根據(jù)測序結果確定SlMYB33過表達載體構建成功。

A. SlMYB33過表達載體的菌液PCR鑒定；M.DNA 分子標記，下同；pCAMBIA2307- SlMYB33質粒為陽性對照 (+)；野生型DNA做陰性對照 (-)；泳道1～5.重組質粒菌落PCR；B. SlMYB33過表達載體的雙酶切驗證；CK.pCAMBIA2307- SlMYB33質粒；1～2.雙酶切驗證

2.3 SlMYB33過表達番茄植株的鑒定

利用農桿菌介導法將SlMYB33過表達載體轉入番茄中，通過PCR鑒定篩選陽性植株。如圖3-A所示，鑒定出11個轉基因株系，進一步對轉基因株系中的SlMYB33表達進行檢測。qPCR結果顯示，轉基因株系OE3、OE4、OE5、OE6、OE7中的SlMYB33表達顯著上調(圖3- B)，其中在OE4、OE5、OE7中的表達量均為WT的 10倍以上，因此選擇這3個株系進行下一步 分析。

A. SlMYB33過表達株系的PCR鑒定；M.DNA 分子標記；野生型DNA做陰性對照(-)；泳道1～11.植株PCR鑒定結果；B.轉基因植株中的 SlMYB33的表達分析；星號表示過表達株系和野生型之間的顯著差異(* P<0.05，** P<0.01；Student’s t-test), 下圖同

2.4 SlMYB33過量表達對番茄開花時間的 影響

鑒于其他作物GAMYB對開花的影響，筆者統(tǒng)計了SlMYB33過表達T1代植株的開花時間，發(fā)現(xiàn)OE4、OE5、OE7株系的始花節(jié)位為6～9，顯著大于野生型的4.7(圖4-B)，表明SlMYB33過量表達導致番茄開花延遲；與之對應的是，SlMYB33過表達株系中第一朵花開放時間同樣推遲，如OE4和OE7播種后52～61 d第一朵花開放，明顯長于野生型的43.7 d (圖4-A，C)。

A.野生型和 SlMYB33過表達株系T1代。標尺=10 cm;B.野生型和 SlMYB33過表達株系T1代的始花節(jié)位統(tǒng)計。試驗設置6個生物學重復，下圖同；C.野生型和 SlMYB33過表達株系T1代中第一朵花開放時間

2.5 SlMYB33過量表達對番茄果實發(fā)育的影響

為進一步了解SlMYB33是否影響番茄果實發(fā)育，對SlMYB33過表達株系中的果實表型進行分析(圖5-A)。結果發(fā)現(xiàn)，OE4、OE5、OE7株系的成熟果實橫徑為 23.16～26.20 mm，縱徑為20.54～22.03 mm，顯著大于野生型的橫徑 16.17 mm、縱徑15 mm(圖5-B)，表明SlMYB33的上調可促使番茄果實增大。

A. SlMYB33-OE系果實顯著大于野生型。標尺=1 cm；B.果實橫縱徑

3 討論與結論

GAMYB是GA信號傳導途徑的關鍵組成部分，其在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。目前，關于GAMYB的研究主要集中在種子萌發(fā)[1,40]、開花誘導[28-29,37,41]和花器官發(fā)育[22-23,30,35-36]等方面。本研究初步鑒定了番茄中GAMYB同源基因SlMYB33的功能，發(fā)現(xiàn)其可以調控番茄的開花時間(圖4)，說明GAMYB在不同作物間具有保守功能[28-29,37,41-43]。此外，本試驗還揭示了SlMYB33對番茄果實大小的影響(圖5)，為進一步探討GAMYB在植物果實發(fā)育方面的作用奠定了基礎。

GAMYB是植物開花誘導的促進因子[24]，而SlMYB33在番茄中的過量表達卻推遲開花(圖4)，推測SlMYB33對開花時間的影響存在劑量效應，即SlMYB33的過量會起到反效果。這種生物學現(xiàn)象在其他物種中同樣出現(xiàn)，例如，大麥HvGAMYB的超量表達抑制了雄蕊發(fā)育，類似于GA過量對雄蕊的影響[6,23,44]。

前人研究表明，在GAMYB調控植物開花過程中，LFY是其下游目標基因，即GAMYB通過激活LFY的轉錄誘導植物開花[28,45-46]。番茄中Falsiflora(FA)是LFY同源基因，其功能缺失突變體表現(xiàn)為開花延遲表型[46]。因此推測，番茄FA有可能是SlMYB33的下游靶基因?？傊M管SlMYB33對番茄開花具有非常重要的作用，但其調控機制尚不清楚，有待進一步研究與驗證。

此外，前人對于GAMYB調控植物開花和花發(fā)育的作用機制有了較為深入的研究，但在果實發(fā)育調控方面涉及較少。而本研究初步證實了SlMYB33在番茄果實大小調控中的作用，但目前對其調控機制的探討有待進一步挖掘。番茄果實大小受到一系列基因的調控，如FW2.2、FW11.3、OVATE、SUN、FASCIATED(FAS)和LOCULENUMBER(LC)等[47-56]，而SlMYB33與這些基因是否存在調控關系以及如何調控將是揭示SlMYB33調控番茄果實大小分子機制的關鍵。

綜上，本研究初步分析了番茄中GA信號轉導因子SlMYB33的表達模式和生物學功能，證明其在番茄開花和果實發(fā)育中的作用。下一步將通過定點基因編輯技術獲得SlMYB33的功能缺失突變體，對該基因的功能在花和果實發(fā)育等方面進行深入研究，同時篩選鑒定其上下游調控基因，對SlMYB33調控番茄生長發(fā)育的分子機理展開研究。