張曉崗, 劉 萍，馬 琨，王 娜

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.西北土地退化與生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，銀川 750021)

馬鈴薯由于其抗旱、高產(chǎn)、耐瘠薄等優(yōu)點(diǎn)，是寧夏南部山區(qū)特色優(yōu)勢作物之一[1]，隨著加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，寧夏南部山區(qū)馬鈴薯栽培面積持續(xù)擴(kuò)大，輪作倒茬越來越困難，連作年限的不斷上升，致使該地區(qū)馬鈴薯根際土壤中菌群種類和數(shù)量發(fā)生改變，土壤微生物多樣性下降[2-3]，病原真菌種群過渡成為優(yōu)勢種群，生防菌數(shù)量明顯下降，根際微生態(tài)環(huán)境惡化，導(dǎo)致馬鈴薯病蟲害發(fā)生嚴(yán)重、產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降[4-5]，如何減輕馬鈴薯連作障礙的發(fā)生已成為亟待解決的 問題。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，其多樣性和豐度是可持續(xù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的標(biāo)志[6-7]，在自然界物質(zhì)循環(huán)過程中起著不可替代的作用，對土壤健康的保持極為重要[8]，不同培肥措施[9]、耕作制度[10]都會(huì)影響馬鈴薯根際土壤中細(xì)菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)。間作生產(chǎn)中由于各作物需肥特性和生理生長周期等的不同，可在時(shí)間、空間上通過種間作物促進(jìn)和互利提高各自對水、肥、氣、熱等資源的利用，直接或間接影響作物的地上和地下部生長發(fā)育[11-12]。間作物的選擇會(huì)影響根際土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成，改善土壤微環(huán)境[13-15]，因而間作栽培下作物對資源的高效利用主要表現(xiàn)在極大地提高作物的產(chǎn)量[16]。魏?；鄣萚17]認(rèn)為，馬鈴薯與玉米間作栽培后提高了土壤微生物群落中以羧酸類化合物、多聚合物、胺類化合物為碳源的微生物類群代謝活性，Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)玉米與馬鈴薯組合的農(nóng)作制度具有“超產(chǎn)”效應(yīng)。土壤特性是影響真菌種群的重要因素之一，鄧文等[19]研究表明，桑樹間作大豆后桑樹根際土壤真菌多樣性降低，但根際土壤微生物群落的碳代謝多樣性增強(qiáng)，土壤養(yǎng)分條件得以改善。馬玲等[20]研究認(rèn)為馬鈴薯與玉米、蠶豆間作并接種從枝菌根真菌(Gloumusetunicatum)后，土壤微生物功能多樣性增強(qiáng)，土壤真菌比例上升，細(xì)菌和放線菌比例下降；可見，選擇合理的間作物調(diào)控方式可以作為緩解作物連作栽培障礙、穩(wěn)定其生產(chǎn)的一種有益探索。本研究根據(jù)寧夏南部山區(qū)氣候和作物的生長特點(diǎn)，設(shè)計(jì)馬鈴薯‖玉米、馬鈴薯‖蠶豆以及不同馬鈴薯品種間作的栽培模式，研究間作栽培后馬鈴薯根際土壤真菌的多樣性，揭示土壤真菌菌群的結(jié)構(gòu)變化，旨在探尋適宜的間作栽培模式，為緩解寧夏南部山區(qū)馬鈴薯連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地設(shè)在寧夏固原市隆德縣沙塘鎮(zhèn)和平村(106.02°E， 35.59°N)，海拔1 883 m，屬半干旱黃土丘陵地帶，年均降水量523.1 mm。土壤為黑壚土。試驗(yàn)地已經(jīng)連續(xù)種植3 a以上馬鈴薯，耕作層土壤有機(jī)質(zhì)33.84 g·kg-1，全氮1.19 g·kg-1，全磷1.02 g·kg-1，堿解氮34.65 mg·kg-1，速效磷35.43 mg·kg-1，速效鉀 80.90 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和土樣采集

選擇已連作3 a以上馬鈴薯的田塊，單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積9 m×25 m，重復(fù)3次。具體設(shè)計(jì)見表1。

馬鈴薯‖玉米、馬鈴薯‖蠶豆間作種植時(shí)馬鈴薯行株距為40 cm×40 cm，玉米行株距為40 cm×35 cm，蠶豆行株距為20 cm×20 cm；間作所用馬鈴薯品種為‘隴薯3號(hào)’(A)，玉米為‘長城706’，蠶豆為‘青蠶9號(hào)’；不同馬鈴薯品種間作選用的是‘隴薯3號(hào)’(A)‘青薯9號(hào)’(B)和 ‘莊薯3號(hào)’(C)，以連作3 a以上的‘隴薯3號(hào)’(A)為對照，四周設(shè)保護(hù)行。分別在馬鈴薯播種前(4月4號(hào))、開花期(7月29號(hào))和成熟期(10月7號(hào))采集土壤樣品。播種前土樣按照對角線5點(diǎn)式采集，每個(gè)樣點(diǎn)取5～20 cm 深度范圍的耕作層土壤充分混勻；開花期和成熟期按5點(diǎn)式采集緊鄰間作物的馬鈴薯A附著于根毛表面的土壤(根際土)，裝入無菌自封袋后充分混勻，重復(fù)3次。所有土樣冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室，迅速過2 mm篩子，-70 ℃保存，備用。

表1 馬鈴薯不同間作栽培試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of different intercroppings in potato

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤微生物總DNA的提取 土壤微生物總DNA采用試劑盒(OMEGA公司)提取，10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA質(zhì)量。

1.3.2 真菌ITS片段的擴(kuò)增、酶切、毛細(xì)管電泳和測序分析 用FAM熒光標(biāo)記的真菌通用引物ITS1-HEX(5′-CTTGGTCATTTAGAAGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增土壤真菌ITS片段[21]。每份土樣重復(fù)3次，為防止PCR偏差，每次PCR擴(kuò)增采用5管平行，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照秦越等[3]的報(bào)道。混勻5管擴(kuò)增產(chǎn)物，取少量產(chǎn)物用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ和MspⅠ(NEB(北京)有限公司)分別酶切，酶切產(chǎn)物避光低溫送至生工生物工程(上海)股份有限公司，在ABI自動(dòng)測序分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，記錄片段大小和峰面積等有關(guān)信息。

1.3.3 土壤真菌ITS基因文庫構(gòu)建、陽性克隆子篩選及ITS片段測序 土壤真菌ITS擴(kuò)增片段的DNA條帶經(jīng)切膠回收、純化，產(chǎn)物連接至pMD18-T載體(Takara)后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有 IPTG和 X-gal的LB平板上(Amp，100 mg·mL-1)，37 ℃黑暗倒置培養(yǎng)12～16 h，獲得土壤真菌的ITS基因文庫。從每份土樣所構(gòu)建的ITS文庫中隨機(jī)挑取白色菌落擴(kuò)繁后用引物ITS1-HEX和ITS4進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測為陽性克隆子的對應(yīng)菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，每個(gè)ITS基因文庫檢測80個(gè)以上的陽性克隆子。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

選擇長度為37 bp～609 bp且熒光強(qiáng)度超過50 RFU(Relative fluorescence units，相對熒光單位)的T-RFs有效片段進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，根據(jù)有效T-RFs的數(shù)目及其豐度用BIO-DAP軟件分別計(jì)算真菌的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)[22]，本文中所有數(shù)值均為兩個(gè)酶切結(jié)果的平均值。應(yīng)用CExpress軟件對測序結(jié)果去載體以獲得真菌ITS片段的基因序列，登錄The National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫，將ITS片段的基因序列與數(shù)據(jù)庫中已有的基因序列比對，找出與克隆子同源性最高的序列，確定其菌屬地位，計(jì)算各分類水平的真菌比例；運(yùn)用PAST 2.03軟件對各栽培模式下馬鈴薯根際土壤真菌目水平菌群結(jié)構(gòu)作主成分分析(Principal components analysis，PCA)。

所有數(shù)據(jù)均用Office 2007處理，用DPS v 7.05進(jìn)行方差分析(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培模式下馬鈴薯根際土壤真菌多樣性分析

物種豐富度反映的是土壤微生物群落功能多樣性，用Shannon-Wiener指數(shù)表示，優(yōu)勢度反映的是土壤微生物群落中最常見的物種，用 Simpson指數(shù)表示[23]。運(yùn)用T-RFLP技術(shù)分析不同栽培模式下馬鈴薯播種前、開花期和成熟期根際土壤真菌的多樣性，與連作相比，間作栽培后無論是開花期還是成熟期，馬鈴薯的根際土壤真菌Shannon-Wiener指數(shù)均有不同程度降低(表2)，具體表現(xiàn)為在開花期間作栽培后馬鈴薯根際土壤真菌的Shannon-Wiener指數(shù)均顯著低于連作 (P<0.05)，在成熟期除P‖F(xiàn) 2∶3行比以及不同馬鈴薯品種間作外，其Shannon-Wiener指數(shù)也低于連作，但差異不顯著；間作栽培后P‖F(xiàn) 3∶2、2∶3行比以及不同馬鈴薯品種間作根際土壤真菌的Simpson指數(shù)變化與連作栽培差異顯著 (P<0.05)，但與P‖M間作差異不明顯?？梢姡煌魑镆约巴N作物不同品種間作對降低馬鈴薯根際土壤真菌的多樣性均有效果。

表2 不同栽培模式下馬鈴薯根際土壤真菌多樣性比較Table 2 Diversity of fungi in potato rhizosphere soil under different cropping patterns

2.2 不同栽培模式下馬鈴薯根際土壤真菌的豐富度和主成分分析

利用GenBank數(shù)據(jù)庫對各間作和連作栽培中馬鈴薯開花期和成熟期根際土壤真菌ITS序列的測序結(jié)果進(jìn)行比對和菌群分析，連作栽培的馬鈴薯在開花期根際土壤中檢測到6個(gè)門、11個(gè)綱、15個(gè)目的真菌，在成熟期的根際土壤中檢測到5個(gè)門、15個(gè)綱、21個(gè)目的真菌；馬鈴薯間作栽培后根際土壤中真菌的物種豐富度在門、綱和目的分類學(xué)水平上與連作栽培模式相比發(fā)生較大差異，真菌門、綱、目的數(shù)量都有明顯的下降，尤以綱和目的比例降幅大(圖1)，開花期綱和目的比例分別平均下降40.26%和27.62%，成熟期綱和目的比例分別平均下降44.90%和40.71%，其中P‖M和P‖F(xiàn)兩種間作栽培模式在成熟期綱和目比例下降均接近45%，但馬鈴薯品種間間作在開花期和成熟期綱和目的下降比例顯著低于P‖M和P‖F(xiàn)兩種間作模式(P<0.05)，表明從改善根際土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)效果來看，馬鈴薯與玉米或蠶豆間作模式比馬鈴薯品種間間作模式的效果好。

圖1 不同栽培模式下馬鈴薯根際土壤真菌豐度Fig.1 Abundance of fungi at phylum, class and order in potato rhizosphere soil under different cropping patterns

主成分分析(PCA)結(jié)果表明(圖2)，在馬鈴薯開花期和成熟期第一、第二排序軸的累積貢獻(xiàn)率分別為79.211%和81.658%，可直觀反映出馬鈴薯不同栽培模式下根際土壤真菌在目水平上菌群結(jié)構(gòu)的差異。在開花期，P‖M 4∶1、3∶2、2∶3、P‖F(xiàn) 4∶1、3∶2與PAM的菌群結(jié)構(gòu)空間距離較遠(yuǎn)，P‖F(xiàn) 2∶3和A‖B‖C與PAM的空間距離相對較近；在成熟期，P‖M 4∶1、3∶2、2∶3以及P‖F(xiàn) 4∶1與PAM的空間距離較大，P‖F(xiàn) 3∶2、2∶3和A‖B‖C與PAM的菌群結(jié)構(gòu)空間距離小，說明不同間作栽培模式對根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同響應(yīng)。縱觀兩個(gè)生育時(shí)期，可以認(rèn)為P‖M間作栽培模式與連作栽培的真菌群落結(jié)構(gòu)差異最大。

A.開花期；B.成熟期

2.3 P‖M不同栽培模式下馬鈴薯成熟期根際土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)和功能分析

由于P‖M間作后對馬鈴薯成熟期根際土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)影響最大，故進(jìn)一步對其ITS片段的測序結(jié)果開展目以下屬的分類和功能研究。除去未能在NCBI上比對到的屬以外，連作栽培模式下共檢測到31個(gè)屬，P‖M間作后4∶1、3∶2和2∶3 3種行比分別檢測到17、10和25個(gè)屬的真菌，與連作栽培相比，3種間作栽培模式下屬的比例分別下降45.16%、67.74%和19.35%，以P‖M 3∶2行比下降的比例最大。間作栽培后，Mitosporic屬、黑孢屬(Nigrospora)、地絲霉屬(Geomyces)、圓盤菌屬(Orbilia)、枝頂孢屬(Acremonium)、四枝孢屬(Tetracladium)、鬼傘屬(Coprinus)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、隱球菌屬(Cryptococcus)共9個(gè)屬的真菌消失(表3)，這其中不乏有能夠引起馬鈴薯病害的真菌，如絲核菌屬(Rhizoctonia)的立枯絲核菌(R.solani)可在土壤中存活數(shù)年，誘發(fā)馬鈴薯立枯絲核菌潰瘍病[24]，鏈格孢屬(Alternaria)的茄鏈格孢菌(A.solani)引起馬鈴薯早疫病[25]。

在馬鈴薯成熟期只有小球殼屬(Plectosphaerella)和鐮孢菌屬(Fusarium)在4種栽培模式中同時(shí)出現(xiàn)，但P‖M 3種間作栽培模式下鐮孢菌屬的比例明顯低于連作栽培；3種間作模式共新增24個(gè)屬的真菌，除去NCBI中未能比對到的屬外，對有分類結(jié)果的菌屬進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，間作后新出現(xiàn)的菌屬，多數(shù)都有利于作物的生長，P‖M 3∶2行比間作后新出現(xiàn)了毛殼屬(Chaetomium)和巨孢囊霉屬(Gigaspora)的真菌，且巨孢囊霉屬的比例高達(dá)60.35%，巨孢囊霉屬是叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi) 的重要菌屬，與植株形成共生體，不僅能改善連作土壤的理化性狀，加速養(yǎng)分循環(huán)利用，形成良好的土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物根系良好生長，還能增強(qiáng)植物對不良環(huán)境的耐受力和對病蟲害的抵抗能力[20,26]；毛殼屬的真菌具有很強(qiáng)的分解纖維素的能力[27]。P‖M 4∶1行比間作后出現(xiàn)的小球腔菌屬(Pleosporineae)的代謝產(chǎn)物對致病真菌-雪腐鐮刀菌(Fusariumnivale)有活性[25]；P‖M 2∶3行比間作后出現(xiàn)的粘鞭霉屬(Gliomastix)中許多真菌種有分解纖維素的能力，在自然界物質(zhì)循環(huán)中有重要作用[28]，可見，P‖M間作栽培能有效改善真菌菌群結(jié)構(gòu)。

表3 馬鈴薯玉米間作栽培成熟期根際土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis of fungi communities in potato rhizosphere soil at mature period of potato and maize intercropping

3 討論與結(jié)論

本研究采用T-RFLP技術(shù)分析不同栽培模式下馬鈴薯根際土壤真菌的多樣性，該技術(shù)可在 18S rDNA 序列上區(qū)分真菌種類的差異。每一個(gè)特異的 T-RF至少代表一種真菌，利用T-RFs的多樣性可以快速而準(zhǔn)確地對土壤真菌種類進(jìn)行分型，估計(jì)樣品中存在的最低限度的真菌物種數(shù)目。由于目前關(guān)于真菌的數(shù)據(jù)庫信息不夠完善，因此本研究在進(jìn)行T-RFLP分析的同時(shí)還構(gòu)建真菌ITS基因文庫，其中每個(gè)基因文庫選擇80個(gè)陽性克隆子測序用于分析根際土壤的真菌組成情況。盡管如此，本研究構(gòu)建的基因文庫覆蓋率依然較低，因此要全面反映馬鈴薯間作栽培后根際土壤中真菌的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)，還需挑取更多的陽性克隆子進(jìn)行測序分析，以使基因文庫的庫容足夠大。

本研究應(yīng)用ITS克隆文庫法分別構(gòu)建P‖M、P‖F(xiàn)、馬鈴薯不同品種間作栽培和馬鈴薯連作栽培模式下馬鈴薯根際土壤的真菌基因文庫，菌群結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為馬鈴薯與玉米、蠶豆或不同馬鈴薯品種間作后，馬鈴薯根際土壤的真菌主要類群結(jié)構(gòu)在門、綱和目分類水平上發(fā)生改變，特別是P‖M間作后一些有害的致病真菌菌屬消失或比例下降，隨之出現(xiàn)部分有益于作物生長的功能真菌，它們或參與纖維素降解，或?qū)ζ渌麧撛谥虏【疝卓棺饔?，或作為叢枝菌根真菌與植物根系形成互利共生關(guān)系，影響根系分泌物和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成以促進(jìn)植物生長[29-30]，在供給植物氮、磷，增加植物生產(chǎn)力和提高植株抗病能力等方面均起到了重要作用，使得植株根際的微環(huán)境得到有效改善[31]。此研究結(jié)果與王娜等[32]對馬鈴薯間作后根際土壤細(xì)菌多樣性研究的結(jié)果相 吻合。

結(jié)合各栽培模式下真菌菌群多樣性、有害菌群下降的數(shù)量和菌群功能的綜合分析，認(rèn)為P‖M間作對馬鈴薯根際土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)影響最大，尤以3∶2行比間作效果最好，間作后真菌屬的比例下降最多，新出現(xiàn)的叢枝菌根真菌巨孢囊霉屬比例高達(dá)60.35%，因而有效改善了間作后馬鈴薯根際土壤的微環(huán)境，緩解了馬鈴薯連作 障礙。