劉 放，魏小紅，張小芳，朱雪妹，馮 悅

(1.甘肅農業(yè)大學 生命科學技術學院,蘭州 730070；2.甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室,蘭州 730070；3.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,蘭州 730070)

番茄黃化曲葉病毒病 (Tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCVD)是由黃化曲葉病毒( Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV簡稱TY)引起的一種對番茄產生毀滅性危害的一種病害，屬于雙生病毒科(Family Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)[1]的一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物DNA病毒[2]。最早在20世紀50年代后期發(fā)現(xiàn)于阿拉伯半島的西北部等地區(qū)[3]，1964年被命名為黃化曲葉病毒病[4]，煙粉虱(Bemisiatabaci)是其主要的傳播方式[5]。中國首次于2006年在上海發(fā)現(xiàn)黃化曲葉病[6]，近年來，該病毒已在上海、北京、新疆、安徽、浙江、天津、四川、陜西等地區(qū)大范圍爆發(fā)[7]。目前針對對番茄黃化曲葉病毒病的防治主要以控制煙粉虱為主，但由于煙粉虱繁殖能力及其遷飛能力頻率較高，并未取得理想的防治效果，目前抗病品種選育是當前防治TYLCV的最好方法之一[8-10]。

植物的防衛(wèi)反應是由酶催化產生的一系列復雜生理生化代謝的結果[11]，防御酶是植物體內抵制病原侵染的有關物質，其活性的變化通常作為衡量植物體內防衛(wèi)反應的重要指標[12]。研究表明，其活性的高低與植物的抗病能力之間存在正相關關系[13-14]。目前已經(jīng)在一些野生番茄中發(fā)現(xiàn)TYLCV的抗性基因，包括Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和ty-5、Ty-6等[15]，其中Ty-1、Ty-2和Ty-3在中國番茄種質資源中開發(fā)和利用較多[16]。這些抗性基因在育種中已成功應用，如瑞士先正達公司選育的‘拉比’和‘齊達利’里面都含有Ty-3a基因，法國 Clause 公司選育的‘寶麗’含Ty-3a基因，中國選育的‘浙粉701’含Ty-2基因，‘浙雜502’含有Ty-3a基因[17]。為了更加方便快捷地檢測番茄攜帶抗性基因，針對 TYLCV 主要的抗性基因開發(fā)了一系列的分子標記[18]。如Ty-1、Ty-2和Ty-3/Ty-3a基因的 SCAR標記，這些分子標記在抗感品系間均表現(xiàn)出長度多態(tài)性，能夠區(qū)分純合、雜合品系，成為與 TYLCV 抗性基因緊密連鎖的共顯性標記，可以方便、快捷、可靠地檢測大量個體[19]。

本試驗選用17份番茄材料，通過苗期人工接種黃化曲葉病毒，從病情指數(shù)、防御酶活性的變化、抗性基因的檢測三方面研究番茄材料對番茄黃化曲葉病毒病的抗性，為篩選和培育番茄黃化曲葉病毒病抗病番茄材料提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的15份番茄育種材料由甘肅張掖益新泉蔬菜育種公司提供，編號分別為801、802、803、805、806、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867?！R達利’(先正達種子公司提供)為陽性對照，‘Money Maker’(MM)(中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所鮮食番茄課題組提供)為陰性對照。用于苗期接種的 TY-DNA 侵染性克隆 pBin-PLUS-1.7A+2β(農桿菌)引自浙江大學周雪平教授實驗室。

1.2 方 法

1.2.1 番茄苗的培養(yǎng) 將以上17份番茄材料種子用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，于2019年4月9日播種于50孔的育苗穴盤中，置于甘肅農業(yè)大學育苗基地培養(yǎng)，當番茄幼苗長出1～2片真葉時，將其定植于花盆中。

1.2.2 pBin-PLUS-1.7A+2β的培養(yǎng) 準備含 Kan(50 mg/L)和 Rif(50 mg/L)的固體 LB 培養(yǎng)基和液體LB培養(yǎng)基，取含 pBin-PLUS-1.7A+2β的農桿菌菌液，在固體LB培養(yǎng)基上涂板，靜置于28 ℃培養(yǎng)箱，倒置暗培養(yǎng)，待長出單菌落，挑取之于LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 28 ℃培養(yǎng)，過夜搖菌。當菌液 600 nm波長處的吸光值達0.6～0.8時，可用于注射接種。

1.2.3 接種病毒 接種前一天給幼苗澆足水,使葉片細胞吸水飽脹,便于注射侵染。接種時采用葉片人工注射接種。將容量為1 mL的注射器去除針頭，吸取菌液，番茄葉背壓力注射至可觀察到菌液滲入，每株 0.2 mL左右，每個番茄材料幼苗各接種20株。接種后20、30、40 d調查發(fā)病情況并取番茄葉組織，進行苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性測定，試驗設3次重復。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 番茄材料病情調查與分析 病情分級參照 Lapidot等[20]的抗性分級方法:0級，植株正常生長；1級，新葉輕微卷曲，發(fā)皺，其他正常；2級，葉片一定程度上黃化,發(fā)皺；3級，葉片大面積黃化卷曲，植株矮化；4級，植株嚴重矮化，葉片卷曲黃化嚴重，植株停止生長。根據(jù)通用的番茄病毒病群體分級標準[21]，分為免疫(I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為 0)、高抗(HR，0 < 病情指數(shù)≤2)、抗病(R，2 < 病情指數(shù)≤15)、中抗(MR，15 < 病情指數(shù)≤30)、感病(S，30 < 病情指數(shù)≤100)。病情指數(shù)計算參照以下公式：

病情指數(shù)(DI)=∑(發(fā)病株數(shù)×發(fā)病級數(shù))/(調查總株數(shù)×最高病級數(shù))×100%

病株率=發(fā)病株數(shù)/調查總株數(shù) ×100%

1.3.2 防御酶活性的測定 POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；PPO 活性測定及PAL活性測定參照李翠丹等[22]的方法。

1.3.3 抗性基因的檢測 于2019年5月15日，分別取17份番茄材料的新鮮組織，用液氮速凍，用試劑盒方法提取葉片的總DNA，試劑盒購自天根生物公司。用于番茄抗病基因檢測的引物一共有3對，參考蔣振等[15]、Garcia等[23]、Ji 等[24]，分別為Ty-1、Ty-2、Ty-3，由北京奧克鼎盛生物公司合成，引物序列及擴增長度見表1。PCR體系為20μL ,其中模板DNA 1μL、Master Mix10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、ddH2O 7 μL。PCR擴增反應程序：94 ℃變性3 min后開始循環(huán)，94 ℃變性30 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)結束后，72 ℃繼續(xù)延伸 5 min。PCR產物于 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳 25 min(150V)，最后用Goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 抗性基因名稱、基因型及所需引物統(tǒng)計Table 1 Resistance gene name,genotype and required primer statistics

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)設定3個重復，采用 Microsoft Excel(2016 版) 計算試驗數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并運用 Duncan’s 檢驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 病情調查及分析

從表2可以看出，隨著時間的推移，除免疫和高抗材料外，其他材料的病株率和病情指數(shù)均呈上升趨勢，第20天到第30天上升趨勢最快并在第40天時達到峰值；接種第20天時，805、817、819、820、841、842表現(xiàn)為高抗，853、857、867表現(xiàn)免疫，證明在感病初期對番茄黃花曲葉病毒病是有一定抗性的；接種第30天時，感病材料病株率和病情指數(shù)上升明顯，801、802、806、822、陰性對照MM發(fā)病率和病情指數(shù)均較高，與其他材料有顯著性差異(P<0.01 ,P<0.05)；接種第40天時，大部分感病材料病株率和病情指數(shù)有緩慢上升并趨于平穩(wěn)，感病情況較第30天時變化不大,證明在第40天時已經(jīng)充分發(fā)病。801、802、 803、806、822、陰性對照材料MM病株率和病情指數(shù)達到峰值，發(fā)病最為嚴重，與其他材料有顯著性差(P<0.01,P<0.05)，是較為典型的感病品種。

表2 不同時期番茄材料病情調查結果Table 2 Investigation result of tomato materials in different periods

2.2 番茄幼苗葉片內防御酶活性與抗病性的關系

2.2.1 PAL活性與抗病性的關系 由圖1可以看出，801、805、817、818、820、842隨著時間的推移，酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢并在第30天時達到峰值；陽性對照材料齊達利、802、803、806、819、822、841、853、857、867隨著時間的推移，酶活性則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢并在第20天時達到峰值,說明這些番茄材料在發(fā)病初期就啟動了防御酶系統(tǒng)；陰性對照材料MM酶活性隨著時間的推移則呈現(xiàn)逐步上升的趨勢并在第40天時達到峰值；陽性對照材料‘齊達利’的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 不同番茄材料苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性Fig.1 Phenylalaninase (PAL) activity of different tomato materials

2.2.2 PPO活性與抗病性的關系 由圖2可以看出，801、803、817、822、841、842隨著時間的推移，酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢并在30 d時達到峰值；陽性對照材料齊達利、陰性對照材料MM、802、805、806、818、819、820、853、857、867、857、867隨著時間的推移，酶活性則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢并在20 d時達到峰值；陽性對照材料齊達利、857、867的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.3 POD活性與抗病性的關系 由圖3可以看出，17份番茄材料隨著時間的推移，酶活性呈現(xiàn)逐步降低的趨勢并在20 d時達到峰值，陽性對照材料齊達利的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 不同番茄材料多酚氧化酶(PPO)活性Fig.2 Polyphenol oxidase (PPO) activity of different tomato materials

圖3 不同番茄材料過氧化物酶(POD)活性Fig.3 Peroxidase (POD) activity of different tomato materials

2.3 番茄材料抗性基因的檢測

由圖4可知，對17份番茄材料進行PCR擴增，818、820、853、857、867和‘齊達利’擴增出約750 bp的條帶，均為純合顯性材料Ty-1/Ty-1。801、802、803、805、806、817、819、822、841、842擴增出約630 bp的條帶，均為純合隱性材料Ty-1/Ty-1。MM不含Ty-1基因；801、802、803、805、806、817、818、819、820、841、842、853、857、867和‘齊達利’擴增出約850 bp的條帶，均為純合隱性材料Ty-2/Ty-2。822和MM不含Ty-2基因；853、857、867擴增出約450 bp的條帶，均為純合抗病材料Ty-3/Ty-3。 801、802、803、805、806、817、818、819、820、841、842擴增出約320 bp的條帶，均為純合隱性材料Ty-3/Ty-3。陽性對照材料‘齊達利’為雜合抗病材料Ty-3/Ty-3，陰性對照材料MM不含Ty-3基因。

a. Ty-1PCR擴增產物; b. Ty-2 PCR 擴增產物; c. Ty-3/ Ty-3a PCR擴增產物；1-17.分別為番茄材料801、802、803、805、806、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867、陽性對照‘齊達利’及陰性對照MM；M.marker

3 討 論

近幾年，番茄黃化曲葉病毒病逐漸成為影響番茄產量的限制因素。隨著生物技術的不斷發(fā)展，在抗黃化曲葉病毒病抗性基因及其相關抗病機理方面取得的研究成果，為抗病育種方面提供了扎實的理論基礎[25]。

如何對番茄材料進行客觀的抗性評價對選育新品種至關重要。本研究選用農桿菌接種黃化曲葉病毒，對不同的番茄材料進行病情指數(shù)調查、防御酶活性測定及抗性基因的檢測。結果表明，隨著時間的推移，除853、857、867對番茄黃化曲葉病毒毒病表現(xiàn)為免疫外，其他材料均不同程度的發(fā)病且病情指數(shù)呈上升趨勢,與鄭積榮等[19]研究結論一致。對黃化曲葉病毒病表現(xiàn)為免疫的853、857、867均在接種后的初期防御酶活性達到峰值，說明可能是由于早期防御反應出現(xiàn)較早，酶促反應速度快，催化誘導形成的酚類物質積累早，而其他感病材料不同程度感病且峰值出現(xiàn)較晚，這與馬艷玲等[26]在黃瓜枯萎病抗性研究中得出的結論相同。而防御酶的啟動作為植物抗病的一個表現(xiàn)，在實際栽培中可根據(jù)發(fā)病高峰期到來的時間，合理安排施用化學藥物進行防治。TYLCV 屬于雙生病毒，是一種重組極度頻繁的植物病毒[27]，導致了該病毒極易發(fā)生變異，不同番茄材料所含抗性基因不同，其表現(xiàn)的抗性水平也不同[28-31]。本試驗結果表明，只要含有抗性基因的材料，都表現(xiàn)出不同程度的抗性，而不含任何抗性基因的陰性對照材料MM發(fā)病率和病情指數(shù)則高于其他材料；對番茄黃化曲葉病毒病表現(xiàn)為免疫的853、857、867均含有純合的Ty-1、Ty-3基因，且Ty-1和Ty-3作為一對等位基因，被認為是抗黃化曲葉病毒病的主效基因[32]。目前，中國育種工作者育成一些抗 TYLCV 的番茄品種。這些抗病品種一般也是基于Ty-1和Ty-3抗性基因[33]。因此在 TYLCV 為害嚴重的地區(qū)應盡量選擇含純合Ty-1和Ty-3基因的品種進行栽培。

4 結 論

本研究從表型、生理、分子水平分析17份番茄材料在不同抗病時期的抗病表現(xiàn)并對其所含的抗性基因進行鑒定，篩選出3個免疫材料(853、857和867)和2個高抗材料(817和842)，3個免疫材料均含有純合Ty-1、Ty-3基因且防御酶活性較其他材料高，峰值出現(xiàn)較早。番茄黃化曲葉病毒變異快，不同地區(qū)病毒種類有差異，在育種過程中還需培育多抗基因聚合品種，提高番茄對黃化曲葉病毒病的抗性，是番茄抗病育種中的一個重要研究目標。